层析技术大实验ppt

分辨率是用来判断相邻两组分在层析柱内的分离情况的，是指相 邻两个峰的分开程度，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽 的平均值之比表示。用Rs来表示。
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层析的基本概念
正相色谱与反向色谱 操作容量（交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存 在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。
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柱层析的基本装置
基本装置（Biologic LP system）
溶剂池 层析柱 恒流泵 部分收集器 检测仪 记录仪 梯度混合器
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柱层析的基本操作
选柱
柱长对分辨率影响较大
装柱（柱漏斗）
一般要求填料在柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔 中无气泡，不能分层，连接处无死体积，柱床体积稳定，在较 高的工作压力下不坍塌变形、流速稳定等。
）
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葡聚糖凝胶（ G型）
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex G系列， 它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂） 以醚键相互交联而成。
例：Sephadex G-75
分级分离 吸水率 排阻极限
指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量 例： Sephadex G-50的排阻极限为30,000
例：Bio-Gel P-300，排阻极限为3×105
聚丙烯酰胺凝胶与Sephadex相比
在酸中的稳定性比Sephadex好，在pH为1～10之 间比较稳定 在较强的碱性或较高的温度条件下不如Sephadex 稳定 不长微生物
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琼脂糖凝胶
琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水 半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的链状多糖。 它在100 °C时呈液态，当温度降至45 °C以下时，多糖 链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚 即成为束状的琼脂糖凝胶。
柱层析的许多填料（吸附剂、离子交换树脂或凝胶 等）经过适当方法的处理，又恢复其性能，可以反 复使用多次，这就称为柱子的再生。
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4.2 凝胶层析
基本原理（图） 凝胶的种类和性质 凝胶层析操作的具体问题 凝胶层析的应用
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葡聚糖凝胶（LH型）
Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙 基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶 。
例：Sephadex LH-20
LH型葡聚糖凝胶与G型葡聚糖凝胶相比较
葡聚糖凝胶过滤层析（G型） 葡聚糖凝胶渗透层析（LH型）
LH型葡聚糖凝胶适用于分离脂溶性物质，
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Kav值与蛋白质分子量之间存在线性关系
几种蛋白质的Kav值
名称 细胞色素C 核糖核酸酶 胰蛋白酶 卵清白蛋白 血清白蛋白单体
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Ve-Vo 105.2 120 85 47.4 20.4
Vt- Vo 150.8 164.7 167 148.1 167
Kav 0.70 0.66 0.51 0.32 0.22
分子量的测定 脱盐及去除小分子杂质
常用的是Sephadex G-25等排阻极限较小的凝胶 类型
去热源物质
利用凝胶层析的排阻效应将大分子热源物质与其它 相对分子量较小的物质分开
溶液的浓缩
优点：基本不改变溶液的离子强度和pH值
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凝胶层析测定蛋白质分子质量
Ve − Vo 分配系数Kav K av = Vt − Vo 分离物质在内水体积和外水体积中的比例关系
塔板理论 速率理论
层析的基本概念 层析的分类 基本装置和基本操作
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层析的基本概念
固定相
固定相是由层析基质组成的。它可以是固体物质（如吸附剂，凝 胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅 胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附， 溶解，交换等作用。
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主要的层析法原理
凝胶层析
凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据 物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质 不同而进行分离的一种层析技术。
亲和层析
亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶 和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在 载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进 行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效 的层析技术，具有很高分辨率。
生物化学与分子生物学大实验
——技术理论部分
层析技术
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第四章 层析技术
4.1 层析技术概述 4.2 凝胶层析 4.3 离子交换层析 4.4 亲和层析
9学时
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4.1 层析技术概述
层析法，又称层离法或色谱法（ Chromatography） （历史） 层析的两个重要理论
例：胆固醇、脂肪酸激素等。
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葡聚糖凝胶Sephacryl
Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯 酰胺（N, N’-methylene bisacrylamide）交 联而成，是一种硬性凝胶。 Sephacryl与Sephadex相比有很多优点
化学和机械稳定性更高 耐高温 稳定工作的pH一般为2～11 机械性能较好，比较耐压，可以用较高的流速洗脱 ，分辨率也较高 分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远 大于Sephadex的范围
凝胶的再生和保存
再生：洗涤后重新平衡或按预处理的方法处理后重新装柱 保存：短时间加抗菌剂，长时间脱水干燥保存
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凝胶层析操作的具体问题
洗脱液的选择
一般来说，洗脱液的选择只要能溶解被洗脱物质并 不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防 止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓 度的盐。
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聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺（acrylamide， 简称Acr）为单体，甲叉双丙烯酰胺（N, N’methylene bisacrylamide，简称Bis）为交 联剂，在过硫酸铵-TEMED（四甲基已二胺） 或核黄素-TEMED催化剂的作用下交联而成。
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凝胶层析操作的具体问题
凝胶的选择（排阻极限、粒度）
组别分离是指分离那些相对分子质量之间相差很大的样品 组分分离则是指分离那些相对分子质量之间相差较小的样品 粒度就是凝胶颗粒的大小，而与交联度无关
凝胶的预处理（溶胀、脱气）
计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（mL）/膨胀度（ mL/g） 脱气：抽气、加热煮沸（必须避免在酸或碱中加热）
死时间（t0）及死体积（V0） 保留时间（tR）及保留体积（VR）
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层析法的分类
根据固定相基质的形式分类
纸层析、薄层层析和柱层析
根据流动相的形式分类
液相层析、气相层析和超临界层析
根据分离的原理不同分类
吸附层析 分配层析 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析
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Vt（πr2h或者Vo ＋ Vi） Vo（蓝色葡聚糖2000测定，分子质量200万） Ve（洗脱体积） Kav=－b lgM＋c 在同一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质，根 据上述线性关系绘制标准曲线（以Kav 值为横坐标 ，以lgM 为纵坐标，绘制标准曲线。） 测出未知蛋白的Kav 值，求得该蛋白的分子质量
层析的基本概念
迁移率（或比移值）
在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离 与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示。
相对迁移率
在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离 与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1 ，也可以大于1。用Rx来表示。
分辨率（或分离度）
M/Da 12400 13700 24000 45000 67000
lgM 4.0934 4.1367 4.3802 4.6532 4.8261
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蛋白质的lgM与其Kav值的线性关 系
床体积（Vt）total volume 外水体积（Vo）out volume 内水体积（Vi）inner volume 基质体积（Vg）gel volume
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层析的基本概念
洗脱体积（Ve）elution volume
指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最 大值时的流动相体积。
4.3 离子交换层析
基本原理 离子交换剂的种类和性质 离子交换层析操作的具体问题 离子交换层析的应用
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4.4 亲和层析
基本原理 亲和吸附剂的种类和性质 亲和层析操作的具体问题 亲和层析的应用
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凝胶层析基本原理
分配系数Kav
Ve − Vo K av = Vt − Vo
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凝胶的种类和性质
凝胶的种类和性质
葡聚糖凝胶（dextran）（常见的两大类，商品名分别为 Sephadex（G型和LH型）和Sephacryl ） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）（商品名为Bio-Gel P ） 琼脂糖凝胶（agarose）（瑞典的Sepharose系列、美国的 Bio-gel A系列、英国的Sagavac系列、丹麦的Gelarose系 列和我国的QT系列等 ） 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶（Ultrol Gel AcA34 多孔玻璃珠、多孔硅胶
洗脱
简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱 洗脱液的流速
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柱层析的基本操作
收集、检测、合并及保存
洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。 根据检测结果绘制洗脱曲线：以管号、洗脱体积或 者洗脱时间为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或 活性为纵坐标。 合并前的鉴定 冻干低温保存
柱子的再生
平衡
平衡液体积一般为2～3倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合 填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色 葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是 均匀的。
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柱层析的基本操作
加样
一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。 通常加样量应少于20%的操作容量，加样体积 应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样 体积不超过床体积的1%。
例：Sepharose 6B
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比
室温保存，pH 4～9之间是稳定的 机械强度和孔穴的稳定性都很好（高盐洗脱柱床无明显变化） 吸附作用很小，排阻极限却很大，但分辨率较低。 不耐高温，使用温度以0～30 °C为宜
Sepharose与1,3二溴异丙醇反应，形成Sepharose CL型交联凝胶
以具有立体网状结构的球 形惰性凝胶颗粒为固定相 ，颗粒的表面和内部形成 很多孔穴，且孔穴直径较 一致，若样品中各组分的 分子大小不同，样品进入 凝胶层析柱后，各个组分 向凝胶颗粒的孔穴内扩散 ，能否进入孔穴内部取决 于孔穴的大小和组分分子 的大小。
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凝胶层析基本原理
加样量（1~5％组分分离/10~25%组别分离）
一般组分分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1～5 ％左右，而组别分离时约为凝胶柱床体积的10～25 ％
洗脱速度
影响因素：柱子的长度、凝胶的型号、凝胶的粒度
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凝胶层析的应用
生物大分子的纯化
优点：不改变样品生物学活性
流动相
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液 体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱 剂，薄层层析时称为展层剂。
分配系数
在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的 比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的重要依据 。
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