荧光分析法在生物领域的应用与进展
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摘要：本文综述了荧光分析法在生物领域的研究进展，其中包括检测细胞活性，测定生物样品，研究生物群落动态，研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用等，并展望了荧光分析法在生物领域的应用前景。
关键词：荧光分析法研究进展应用发展前景
0.引言
分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。它有如下特点：灵敏度高，选择性优于吸收光谱法，试样量小，操作简便，发光检测的灵敏度高，发光参数多。正是因为这些优点，荧光分析法在生物领域内获得了广泛的应用。
1.荧光分析法的发展状况
1.1近十年发展状况
近10年来，由于微量分析的需要迅速增加，灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增，内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展，应用遍及各个领域。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿，成为一种重要的仪器分析方法。
1.2荧光分析法在药物分析中被广泛应用
荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐，将荧光分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药物与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学等领域的痕量分析。
常规荧光分析法最早被应用与分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。为使荧光
分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，近年来，还发展了各种新型荧光分析技术，如激光诱导荧光法，同步荧光法等，这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。
2.荧光分析法的基本原理
2.1.荧光产生的机理
2.1.1分子的激发态—单重激发态和三重激发态
电子激发态的多重度：M=2s+1 （S为电子自旋量子数的代数和）
基态单重态：M=2s+1=1
激发单重态：M=2s+1=1
激发三重态：M=2s+1=3[1]
2.1.2分子的去活化过程
处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁或非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速率最快、激发态寿命最短的途径占优势。
2.2激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，既激发光谱和发射光谱。荧光的激发光谱和发射光谱是荧光物质的基本特征，他们是荧光定性和定量分析的基本参数和依据。
荧光光谱的特征：a.斯托克斯（Stokes）位移，b. 镜像规则，c.发射光谱的形状与激发波长无关
3.荧光分析法的注意事项
3.1荧光的减退
荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退。3.2试剂的浓度
有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试剂还有吸收荧光的作用，因此分析时所加试剂的量不可太多。
3.3 pH的影响
大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。
4.荧光分析法在生物领域的应用
4.1荧光分析法检测细胞活性
应用二乙酸荧光素(FDA)-溴化乙锭(EB)双染色同步荧光分光光度法测定细胞活性变化,灵敏度和特异性与普通荧光分光光度法相比较有所提高。方法：FD A-EB对已知比例的死、活细胞双染色,选择△入=40nm进行同步荧光扫描,与普通荧光分光光度法测定值进行比较。结果：该方法与通常的荧光法相比,灵敏度有较大提高,并能确定溶液中死、活细胞比例关系。结论：FDA-EB双染色同步荧光分光光度法可用于细胞活性变化的定性定量分析。[2] [3] [4]
4.2荧光分析法测定生物样品
通过电化学氧化肾上腺素，使其生成羟基吲哚类荧光物质(λem=490nm)，实现了药物中肾上腺素含量的电化学氧化-荧光检测。研究结果表明,荧光强度与肾上腺素浓度分别在2.00×10-7—1.00×10-6mol/L和1.00×10-6—4.00×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为6.70×10-8mol/L。该方法用于药物制剂中肾上腺素含量的测定，相对标准偏差小于1.88%(n=7)，加标回收率为88.4%—116.6%。[5] [6] [7] [8]
4.3荧光分析法研究生物群落动态
目前常用于分析色素浓度的分光光度法灵敏度较低，当样品中色素含量很低时，难以检出[9]。也有研究曾经采用了同步荧光法测定了海洋浮游植物的叶绿素[10]，但至今还未见用于湖泊底泥中色素分析的报道。Yuk等人应用高效液相色谱(HPLC)法分析了Baikal湖湖泊沉积物中的色素L，该方法检测限很低，灵敏度极高。但此法样品前处理过程较为复杂，且成本较高。而荧光分析法灵敏度较高，所需样品量少，更为简便、快速和经济。虽然蓝藻一般在夏季形成水华，但是认识藻类在底泥中初春的动态规律有助于了解水华形成的机理。以太湖梅梁湾地区的底泥为材料，利用荧光分析法测定藻蓝素含量，并用同步荧光分析法同时测定湖泊底泥中的叶绿素a、叶绿素b含量，目的是利用不同色素的定量分析来表征底泥中不同类群藻类的比例，为探讨不同季节底泥中水华蓝藻存在状态与春季蓝藻复苏以及随后水华发生的时空关系提供技术支持。4.4药物小分子与生物大分子的相互作用
