PCR的原理和操作过程

PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1第一轮2 扩增3 4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
退 火 PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程 58℃
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
• 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
第二节 PCR的实验步骤
温 94
度
（℃） 72 55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
变 性 PCR的基模本板原DNA理

PPCCRR反过应程条件95℃
94 ℃预变性，3min 使DNA双链完全打开
Biblioteka Baidu
变性： 94 ℃变性，45s
94 ℃，3min；
使双链DNA解链为单链
94 ℃，45s；
退火： 58℃，1min
58 ℃，1min； 循环3温0度次由引物长度和GC含量决定。
72 ℃，1min； 72 ℃，10min； 16 ℃保温
增加温度能减少引物与模板的非特异 性结合，降低温度可增加反应的灵敏 性。
按照实验方案进行即可
1.加样 将上述总体积为50чl的反应体系加入一无菌
0.5ml离心管中
2离心 将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一
滴矿物油覆盖于反应混合物上
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根
据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
PCR原理和基本操作过程
临床146生化实验小组 2015.12.5
第一节 PCR技术原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核 酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩 增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究 和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性 好、易自动化等突出优点。
PCR基本原理
PCR基本反应步骤
一、PCR的原理
PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其 原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双 链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使 双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火 过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链 模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成， 即变性、退火、引物延伸。
延伸：72 ℃，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 ℃
时间由扩增片段的长度决定
1min扩增1KB
标准的PCR反应体系
10X 扩增缓冲液： 5μl
模板DNA:
0.1~2μg
引物：
各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+:
1.5mmol/L
Taq DNA聚合酶： 2.5U
ddH2O 总体积：
补齐 50μl
可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化
二、三个基本步骤
变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开
退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到
模板DNA互补部位
延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引
物3’端添加DNTP，DNA链不断延伸
反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段： 变性95度，退火55度，延伸72度。
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理

PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的基本原理
第3P轮CR反扩应增条件
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增
PCR的特点
PCR 的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
延伸
PCR的基本原理
PCR反应条件72℃
PCR过程 PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
95℃
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 Taq
PPCCRR反过应程条件5720℃
4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，
其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和 目的不同而采用不同的分析方法
PCR循环参数
（热力学参数）
94 ℃，3min； 94 ℃，45s； 58 ℃，1min； 循环30次 72 ℃，1min； 72 ℃，10min； 16 ℃保温