农杆菌介导的烟草转基因技术
一、实验目的
了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料
1、植物材料：烟草无菌苗
2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121
四、方法步骤
1、试剂的配制
（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0
（3）烟草共培养培养基：固体MS培养基
（4）烟草筛选培养基：
MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0
（5）烟草生根培养基：固体MS培养基
2、农杆菌侵染菌液的制备方法：
（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用
（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）
（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记
（5）28℃恒温培养1d-2d
（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。
3、外植体的制备
准备生长20d健壮的烟草无菌苗，挑选接近植株顶端，完全舒展开且较大的叶片。将叶片平铺在无菌滤纸上，左手拿镊子，右手拿刀。用镊子固定叶片，刀片切去也边缘和叶脉，然后将叶片切成5mm×5mm的正方形，备用。
4、侵染与共培养
取制备好的侵染菌液50mL于三角瓶中，将切好的烟草叶片进入其中，摇晃使菌液与叶片充分接触，侵染10min，期间摇晃三角瓶数次。然后用镊子将叶片夹出，放在无菌滤纸上，吸干其表面的菌液，接种于共培养基上，于25℃培养室暗培养3d。
5、筛选培养和生根培养
从共培养基上取下叶片，预400mg/L的头孢水中浸泡5min，浸泡两次，然后用无菌水清洗三次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，接种于筛选培养基上，25℃光培养，期间每20d 继代一次，直至再生出芽。此时将再生芽切下置于生根培养基上诱导生根。
