功能基因的克隆及生物信息学分析
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^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春,杨莉琴,秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带,测序结果表明该条带为ADWF4基因;生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白,且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时,研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词:拟南芥;BRs;DWF4基因;过表达载体构建DOI:10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号:Q943.2文献标志码:A文章编号:1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract:BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH:2016]7449号);贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才:2018]5781号)作者简介:韦春(1995—),女(壮族)广西河池人;在读硕士,主要从事植物基因工程相关研究(E-mail:*****************).通讯作者:秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人;博士,副教授,硕士生导师,研究方向:植物生物技术与植物基因工程(E-nail:leequine_chin@126.com)。
牛HSL基因的克隆和生物信息学分析刘燕;李赞;田万年【摘要】旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析.根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析.结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271 bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9%.HSL蛋白含有一个HSL-N superfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性.半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达.该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)006【总页数】4页(P9-12)【关键词】克隆;分析;HSL基因;生物信息学;表达谱;牛【作者】刘燕;李赞;田万年【作者单位】辽宁禾丰牧业股份有限公司,辽宁沈阳 110164;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林吉林 132101【正文语种】中文【中图分类】Q785;S823.2激素敏感脂酶(hormone sensitive lipase,HSL)是动物脂肪分解的重要酶之一,动物将体内的脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内,HSL能够把动物体内储存的脂肪进行分解,转变为游离脂肪酸和甘油来满足动物机体的需要,是影响机体脂肪代谢的关键酶和限速酶[1-2]。
目前有关猪的HSL 基因序列分析及表达研究研究报道较多[3-5]。
黄艳娜等[6]对陆川猪激素敏感性脂肪酶基因进行了克隆和序列分析。
⽣物信息学论⽂⽣物信息学课程论⽂⼀个⽟⽶ Mlo 基因的电⼦克隆与⽣物信息学分析姓名:学号:班级:⽣科2班⼀个⽟⽶ Mlo 基因的电⼦克隆与⽣物信息学分析摘要:Mlo 基因家族在植物抗病⽅⾯有极⼤的优势,但有些 Mlo 基因的功能还未知。
经序列拼接电⼦克隆得到 1 个⽟⽶的 Mlo 基因,采⽤⽣物信息学⽅法预测分析了编码蛋⽩的⼀、⼆、三级结构,并对其功能进⾏了预测。
结果表明:⽟⽶ Mlo 基因编码的蛋⽩有⼀个保守的 DUF1084 结构域,此结构域功能在植物中尚未知。
⽣物信息学分析表明,此蛋⽩很可能是⼀种类似于 G 蛋⽩偶联受体的膜结合转运蛋⽩⽽参与到信号传递过程中。
关键词:⽟⽶;Mlo 基因;电⼦克隆;⽣物信息学植物在长期的⽣物进化中形成了⼀系列复杂⽽严密的防御机制,使⾃⾝免受病原物的侵害[1,2]。
抗病基因是植物防御体系中的最重要组成部分。
Mlo 基因最初在⼤麦中被发现,这类基因在植物中编码⼀个七次跨膜结构域的蛋⽩家族,可能起到与 G 蛋⽩偶联受体(G Protein Coupled Receptor,GPCR)类似的功能。
他们的拓扑结构、亚细胞定位和序列多样化与动物和真菌的 G 蛋⽩偶联受体很相似。
野⽣型 mlo 基因赋予⼤麦对⽩粉菌的⼴谱抗性[3]。
⽩粉病是由⽩粉菌引起的真菌性病害,⽩粉菌能侵染650 多种单⼦叶植物和 9 000 多种双⼦叶植物[4,5]。
⽬前已对拟南芥、⽔稻和杨树中的 Mlo 基因家族有深⼊的研究[6]。
电⼦克隆法是近年来基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)和基因组数据库发展起来的基因克隆新型技术[7],具有效率⾼、成本低、对实验条件要求低等特点。
因此可以快速获得⼀些新基因,从⽽使新基因的应⽤成为可能。
挖掘⽟⽶中未知的抗病基因对⽟⽶的抗病育种有很⼤帮助。
本研究以⽟⽶为材料,对其中的⼀个 Mlo 基因进⾏电⼦克隆,并对其进⾏部分⽣物信息学⽅⾯分析,为⽟⽶ Mlo 基因的应⽤及⽟⽶的抗病育种提供理论依据。
2021.3基金项目:山东省自然科学基金项目“β-半乳糖凝集素在禽网状内皮组织增生症病毒感中作用机制研究”(ZR2019MC036);菏泽学院培育基金项目“ATP1B1对禽网状内皮组织增生症病毒复制影响研究”(XY18PY01)。
作者简介:张淑萍(1995.11-),女,山东省高密市人,研究方向:动物疫病。
*通信作者。
梅花鹿Galectin-1基因克隆及生物信息学分析张淑萍1张厚锋2孔娜2温海燕2周宛蓉2姜莉莉2樊兆斌2*(1,山东省菏泽市食品药品检验检测研究院274000;2,菏泽学院药学院274715)摘要:本试验拟克隆梅花鹿半乳糖凝集素-1(Galectin-1)基因,并对其编码产物进行生物信息学预测分析。
根据ncbi 数据库中已发表的梅花鹿Galectin-1mRNA 序列,设计合成梅花鹿Galectin-1基因扩增引物。
提取梅花鹿肝脏组织RNA ,反转录为cDNA 为模板,利用RT-PCR 技术扩增梅花Galectin-1基因序列,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行遗传演化分析,结果显示,梅花鹿Galectin 1基因编码区为408bp ,编码135个氨基酸。
Galectin-1编码蛋白理论分子量为14.69kD ,理论等电点为5.1,不稳定系数为14.87,推测该蛋白为稳定蛋白。
脂肪系数为81.04,总平均亲水指数为-0.145。
Galectin-1编码蛋白不含信号肽,无跨膜区;存在1个潜在的磷酸化位点不含O-和N-糖基化修饰位点;含有7个抗原决定簇区域,抗原倾向指数高。
本试验成功克隆了梅花鹿Galectin-1基因,并对其进行了生物信息学分析预测,为深入研究Galectin-1编码蛋白的功能提供依据,进一步阐明了其生物功能。
关键词:梅花鹿;Galectin-1基因;基因克隆;序列分析半乳糖凝集素(Galectin)属于S 型凝集素,是一类不依赖钙离子的可溶性凝集素,在脊椎动物、无脊椎动物、原生动物和真菌等各种生物体内广泛存在。
中国畜牧兽医 2024,51(4):1372-1381C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析王艳,张 颖,赵雅妮,易 林,史 珍,周长明,周宛蓉,姜莉莉,樊兆斌(菏泽学院药学院,菏泽274015)摘 要:ʌ目的ɔ克隆白来航鸡干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s ,S T I N G )C D S 区序列并进行生物信息学和组织表达分析,为阐明S T I N G 基因在抗病毒免疫应答中的作用奠定基础㊂ʌ方法ɔ采用P C R 扩增并克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区,测序后对其编码氨基酸序列进行相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学预测S T I N G 蛋白的理化特性及结构功能,并利用实时荧光定量P C R 技术检测S T I N G 基因在鸡心脏㊁肝脏等14个组织中的表达情况㊂ʌ结果ɔ白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂相似性比对和系统进化树分析结果表明,白来航鸡S T I N G 基因与原鸡的相似性最高(99.7%),亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,分子质量为42.625k u ,等电点(pI )为6.67,不稳定系数为69.26,脂肪系数为105.01㊂该蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,含有跨膜结构,不含信号肽㊂S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)及无规则卷曲(31.66%)㊂蛋白互作分析表明,白来航鸡S T I N G 蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在相互作用㊂实时荧光定量P C R 结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡组织中广泛表达,其中在肺脏中表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中表达量最低㊂ʌ结论ɔ本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G 基因,其C D S 区序列全长1140b p ,编码379个氨基酸㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白,含有跨膜结构㊂S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中表达量最高㊂研究结果为深入探究白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白功能提供了材料㊂关键词:白来航鸡;S T I N G 基因;克隆;生物信息学;表达中图分类号:S 831;Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.005 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-20基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2019M C 036㊁Z R 2023Q C 302);菏泽学院大学生创新训练项目;菏泽学院新兽药工程重点实验室联系方式:王艳,E -m a i l :1722804585@q q .c o m ;张颖,E -m a i l :3082291255@q q.c o m ㊂王艳和张颖对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者姜莉莉,E -m a i l :l y j l l f x y l 024@163.c o m ;樊兆斌,E -m a i l :438321212@q q.c o m C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c s a n dT i s s u eE x pr e s s i o nC h a r a c t e r i s t i c s o f S T I N G G e n e i n W h i t eL e gh o r nC h i c k e n s WA N G Y a n ,Z H A N G Y i n g ,Z H A O Y a n i ,Y IL i n ,S H I Z h e n ,Z H O U C h a n g m i n g,Z H O U W a n r o n g,J I A N GL i l i ,F A NZ h a o b i n (C o l l e g e o f P h a r m a c y ,H e z eU n i v e r s i t y ,H e z e 274015,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔI nt h i ss t u d y ,t h eC D Sr e g i o ns e qu e n c eo f s t i m u l a t o ro f i n t e r f e r o n g e n e s (S T I N G )g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw a s c l o n e da n da n a l y z e db y bi o i n f o r m a t i c s a n d t i s s u e e x p r e s s i o n ,w h i c h l a i da f o u n d a t i o nf o re l u c i d a t i n g th er o l eo f S T I N G g e n e i na n t i v i r a l i m m u n e r e s p o n s e .ʌM e t h o d ɔT h eC D S r e g i o n o f S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a m p l i f i e db y P C Ra n d c l o n e d .A f t e r s e q u e n c i n g ,t h es i m i l a r i t y o f t h ee n c o d e da m i n oa c i ds e qu e n c eo f S T I N G g e n ew a sc o m p a r e da n dt h e p h y l o g e n e t i ct r e e w a sc o n s t r u c t e d .T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o pe r t i e s a n d s t r u c t u r a lf u n c t i o no f S T I N G p r o t e i nw e r e p r e d i c t e db y b i o i n f o r m a t i c s ,a n d t h e e x pr e s s i o no f4期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析S T I N G g e n e i n14t i s s u e ss u c ha sh e a r t a n d l i v e ro f W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sw e r ed e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R.ʌR e s u l tɔT h e s e q u e n c eo f t h eC D Sr e g i o no f S T I N G g e n e i n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n sw a s1140b p i n t o t a l l e n g t h,e n c o d i n g379a m i n o a c i d s.S i m i l a r i t y a l i g n m e n t a n d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a t S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n sh a d t h eh i g h e s t s i m i l a r i t y w i t h G a l l u s g a l l u s a n d t h e c l o s e s t g e n e t i cr e l a t i o n s h i p,a n d t h ef a r t h e s t g e n e t i c r e l a t i o n s h i p w i t h C o r v u s c o r n i xc o r n i x.S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e g h o r n c h i c k e n sw a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t ha m o l e c u l a rw e i g h to f42.625k u,a n i s o e l e c t r i c p o i n t(p I)o f6.67,a ni n s t a b i l i t y c o e f f i c i e n t o f69.26,a n da f a t c o e f f i c i e n to f105.01.S T I N G p r o t e i n w a ss y n t h e s i z e d m o s t l y o nm i t o c h o n d r i a a n de n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,c o n t a i n e da t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e,a n dn o s i g n a l p e p t i d e.T h es e c o n d a r y s t r u c t u r e o fS T I N G p r o t e i ni n c l u d e d a l p h a h e l i x(54.62%), e x t e n d e dc h a i n(10.29%),b e t at u r n(3.43%)a n dr a n d o m c o i l(31.66%).P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nS T I N Ga n dN F K B1,D D X41,c G A S,T B K1 a n do t h e r p r o t e i n s.T h er e s u l t so fR e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R s h o w e dt h a t S T I N G g e n e w a s w i d e l y e x p r e s s e d i n t h e t i s s u e s o fW h i t eL e g h o r o n c h i c k e n s,w i t h t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n i n l u n g, w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i no t h e r t i s s u e s(P<0.05),a n d t h e l o w e s t e x p r e s s i o n i n p e c t o r a l i s m u s c l e.ʌC o n c l u s i o nɔI nt h i ss t u d y,S T I N G g e n ei n W h i t e L e g h o r nc h i c k e n s w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d,t h e t o t a l l e n g t ho f t h eC D Sr e g i o nw a s1140b p,e n c o d i n g379a m i n oa c i d s. S T I N G p r o t e i n i n W h i t e L e g h o r n c h i c k e n s w a s a n a c i d i c,h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t h a t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e.T h e r e w a st h eh i g h e s te x p r e s s i o no f S T I N G g e n ei nl u n g o f W h i t e L e g h o r o n c h i c k e n s.T h er e s u l t s p r o v i d e d m a t e r i a l s f o r t h e i n-d e p t hs t u d y o f t h e f u n c t i o no f t h e p r o t e i ne n c o d e db y S T I N G g e n e i n W h i t eL e g h o r nc h i c k e n s.K e y w o r d s:W h i t eL e g h o r n c h i c k e n s;S T I N G g e n e;c l o n i n g;b i o i n f o r m a t i c s;e x p r e s s i o n先天性免疫是机体抵御病原微生物的第一道防线㊂宿主编码模式识别受体(P R R s)对来自病原体核酸的识别启动了复杂的信号转导途径,最终产生Ⅰ型干扰素(I F N-Ⅰ)和促炎细胞因子,并激活机体的天然免疫反应[1]㊂环鸟腺苷酸合成酶(c G A S)作为D N A识别受体,能识别并结合胞质双链D N A(d s D N A)[2]㊂当胞质中存在异常d s D N A时,c G A S能催化合成第二信使2 ,3 -c G AM P(c G AM P),结合并有效激活干扰素基因刺激因子基因(s t i m u l a t o r o f i n t e r f e r o n g e n e s,S T I N G),随后S T I N G招募T A N K结合激酶(T B K1)和I K B 激酶(I K K)使其磷酸化,激活导致产生I F N-Ⅰ和干扰素调节因子3(I R F3)㊁核因子κB(N F-κB)等细胞因子的表达[3]㊂S T I N G的功能主要体现在c G A S-S T I N G-I F N 信号通路中㊂c G A S-S T I N G通路除了构成有效的防御组织损伤和病原体入侵的监测系统外,还在自噬㊁翻译㊁代谢稳态㊁细胞凝聚㊁D N A损伤修复㊁衰老和细胞死亡中发挥作用[4]㊂然而c G A S-S T I N G通路的异常或过度激活可导致原发性发病机制和多种自身免疫性疾病[5]㊂家禽马立克病病毒(M D V)和鸡新城疫病毒(N D V)均靶向S T I N G接头蛋白,从而阻碍c G A S-S T I N G通路介导抗病毒天然免疫的应答[6-7]㊂禽痘病毒(F W P V)可以刺激鸡巨噬细胞中的c G A S-S T I N G通路,上调I F N相关因子表达,使宿主有效防御F W P V感染;禽白血病病毒(A L V)通过其编码的P15蛋白抑制激活c G A S-S T I N G通路,从而有助于病毒复制和持续感染[8]㊂S T I N G在细胞因子诱导㊁自噬诱导㊁代谢调节和内质网应激等方面发挥重要功能[9],且在健康和疾病中发挥着至关重要的作用,广泛参与各种细胞过程㊂近年来,靶向S T I N G的激动剂成为国内外抗肿瘤药物研发的新热点,S T I N G激动剂在乳腺癌㊁结肠癌㊁肝癌㊁黑色素瘤及淋巴瘤等肿瘤模型中都展现出了强有力的抗肿瘤活性[10]㊂目前国内外对鸡S T I N G在抗病毒免疫中的研究鲜有报道㊂本研究以白来航鸡为研究对象,克隆S T I N G基因C D S 区,运用在线软件对该基因编码蛋白进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量P C R技术检测S T I N G基因在白来航鸡不同组织中的表达特征,以期为深入探究S T I N G在抗病毒免疫应答中的作用提供参考依据㊂3731中 国 畜 牧 兽 医51卷1 材料与方法1.1 材料供试动物选取同一批次的3只3周龄健康的白来航鸡(菏泽市某养殖场)㊂颈部放血处理后,无菌采集每只白来航鸡的心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁胰脏㊁肺脏㊁肾脏㊁脑㊁胆㊁腺胃㊁十二指肠㊁回肠㊁盲肠㊁直肠㊁胸肌共14个组织置于超低温备用㊂T r i z o l ㊁P r i m e S c r i p t T MR T R e a g e n t K i t w i t h gD N AE r a s e r ㊁D L 2000D N A M a r k e r ㊁限制性内切酶E c o R Ⅰ㊁H i n d Ⅲ均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)购自T a K a R a 公司;T 4D N A 连接酶㊁pE T -28a (+)载体㊁大肠杆菌D H 5α感受态细胞㊁T I A N p r e p Mi n i P l a s m i dK i t 均购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.2 方法1.2.1 引物设计及合成 根据G e n B a n k 中原鸡S T I N G 基因序列(登录号:K P 893157.1),使用P r i m e rP r e m i e r 5.0软件设计普通P C R (下划线处为E c o R Ⅰ和H i n d Ⅲ酶切位点)和实时荧光定量P C R 引物,以G A P DH 为内参基因,引物信息见表1㊂引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂表1 引物序列信息T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e i n f o r m a t i o n 基因G e n e s引物序列P r i m e r s e qu e n c e s (5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m pe r a t u r e /ħ产物长度P r o d u c tl e n g t h /b p 用途A p p l i c a t i o n S T I N G F :C C G G A A T T C A T G C C C C A G G A C C C G T C A A C C 62.81140普通P C R R :C C C A A G C T T C T G G G C T C A G G G G C A G T C A C T S T I N G F :G C C C C A G G A C C C G T C A A C C A G 60.0114实时荧光定量P C R R :A G C A C C A C G A A G C A C A C A G C C AG A P DHF :G A C G T G C A G C A G G A A C A C T A 60.0122实时荧光定量P C RR :A T G G C C A C C A C T T G G A C T T T1.2.2 总R N A 提取及反转录 利用T r i z o l 法提取各组织总R N A ,溶于D N a s e /R N a s e -f r e ed d H 2O ,利用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测R N A 浓度及纯度,将R N A 反转录为c D N A ,―20ħ保存备用㊂1.2.3 S T I N G 基因C D S 区克隆及测序 以白来航鸡脾脏组织c D N A 为模板进行P C R 扩增㊂P C R 反应体系20μL :c D N A 模板0.5μL ,上㊁下游引物(10μm o l /L )各0.5μL ,P C R M a s t e r M i x10μL ,d d H 2O8.5μL ㊂P C R 反应程序:94ħ预变性5m i n ;94ħ变性30s ,62.8ħ退火30s ,72ħ延伸75s ,共35个循环;72ħ延伸7m i n ㊂P C R 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,取鉴定正确的扩增产物回收纯化后连接p E T -28a (+)载体,转化大肠杆菌D H 5α感受态细胞,均匀涂布于含卡那霉素的L B 固体培养基上,过夜培养14h 后筛选出圆滑白色单菌落并进行菌液P C R 鉴定,将挑选得到的阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂1.2.4 生物信息学分析 使用M e g A l i g n 软件将白来航鸡与G e n B a n k 数据中已公布的原鸡(G a l l u s ga l l u s ,登录号:N P _001292081.2)㊁盔珠鸡(N u m i d am e l e a g r i s ,登录号:X P _021265823.1)㊁火鸡(M e l e a g r i s g a l l o pa v o ,登录号:X P _010717095.1)㊁白尾雷鸟(L a g o pu s l e u c u r a ,登录号:X P _042749793.1)㊁日本鹌鹑(C o t u r n i x j a po n i c a ,登录号:X P _015731739.1)㊁凤头朱鹮(N i p po n i a n i p po n ,登录号:K F Q 92075.1)㊁冠小嘴乌鸦(C o r v u s c o r n i xc o r n i x ,登录号:X P _039415878.1)的S T I N G 基因氨基酸序列进行相似性比对,并利用M e ga 7.0软件构建系统进化树㊂利用P r o t P a r a m 在线软件(h t t ps :ʊw e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)分析S T I N G 蛋白理化性质;利用P r o t S c a l e 在线软件(h t t p s :ʊw eb .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /)分析S T I N G 蛋白亲/疏水性;利用S i g n a l P4.1(h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g n a l P -4.1/)㊁T MHMM (h t t ps :ʊs e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /)在线软件分别预测S T I N G 蛋白信号肽与跨膜区;利用S M A R T (h t t p :ʊs m a r t .e m b l -h e i d e l b e r g .d e /s m a r t /b a t c h .p l )和P S P R TⅡ(h t t p :ʊp s o r t .h g c .j p/f o r m 2.h t m l )在线软件分别预测S T I N G 蛋白结构域和亚细胞定位;利用47314期王艳等:白来航鸡S T I N G基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析N e t P h o s3.1在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e.p h p?N e t P h o s-3.1)预测S T I N G 蛋白磷酸位点;利用Y i n O Y a n g1.2(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/Y i n O Y a n g-1.2/)和N e t N G l y c1.0(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分别预测S T I N G蛋O-糖基化和N-糖基化位点;通过P r a b i S O P MA(h t t p s:ʊn p s a.l y o n.i n s e r m.f r/c g i-b i n/s e c p r e d_s o p m a.p l)和S W I S S M O D E L(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)在线软件分别预测S T I N G蛋白二级结构和三级结构;利用S T R I N G12.0在线软件(h t t p s:ʊv e r s i o n-12-0. s t r i n g-d b.o r g/)和C y t o s c a p e软件进行蛋白互作分析㊂1.2.5白来航鸡S T I N G基因组织表达特性检测以鸡14个组织c D N A为模板,利用实时荧光定量P C R检测S T I N G基因在白来航鸡各组织中的相对表达情况,以G A P DH作为内参基因㊂P C R 反应体系10μL:c D N A0.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.3μL,S Y B R P r e m i x E x T a q T M (2ˑ)5μL,d d H2O3.9μL㊂P C R反应程序:95ħ2m i n;95ħ15s,60ħ1m i n,共45个循环;熔解程序:95ħ15s,60ħ1m i n;95ħ15s㊂每个组织样品设3个重复,采用2―әәC t法计算相对表达量㊂1.3数据统计分析通过S P S S26.0软件中单因素方差分析对基因表达量进行显著性检测,采用L S D和邓肯式法进行多重比较,利用G r a p h P a dP r i s m8.0软件作图㊂结果用平均值ʃ标准差表示,P<0.05表示差异显著㊂2结果2.1白来航鸡S T I N G基因C D S区序列克隆1.0%琼脂糖凝胶电泳显示,在约1140b p附近出现清晰条带(图1),与预期条带大小符合㊂应用D N AMA N软件分析测序结果显示,本试验克隆的白来航鸡S T I N G基因C D S区片段长为1140b p,编码379个氨基酸,碱基组成分别为: A(17.54%)㊁G(30.35%)㊁T(18.16%)㊁C(33.95%), G C含量高于A T含量,说明白来航鸡S T I N G基因C D S区的D N A双链较稳定㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1~3,S T I N G基因P C R扩增产物;4,阴性对照M,D L2000D N A M a r k e r;1-3,P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f S T I N G g e n e;4,N e g a t i v e c o n t r o l图1白来航鸡S T I N G基因P C R扩增结果电泳图F i g.1E l e c t r o p h o r e t i c m a p o fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so f S T I NG g e n e i n W h i t eL e i g h o r n c h i c k e n s2.2生物信息学分析2.2.1相似性比对及系统进化树构建相似性比对结果显示,白来航鸡S T I N G基因编码氨基酸序列与原鸡㊁灰胸竹鸡㊁环颈雉㊁盔珠鸡㊁火鸡㊁白尾雷鸟㊁日本鹌鹑㊁朱鹮和冠小嘴乌鸦的相似性分别为99.7%㊁93.7%㊁89.1%㊁87.3%㊁90.2%㊁87.3%㊁83.6%㊁63.9%和62.0%(图2)㊂采用M e g a7.0软件中M L法构建系统进化树,结果显示,白来航鸡与原鸡之间的亲缘关系最近,与灰胸竹鸡的亲缘关系次之,朱鹮和冠小嘴乌鸦形成另一个分支,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远(图3)㊂2.2.2理化特性分析白来航鸡S T I N G蛋白分子式为C1897H3032N530O541S22,分子质量为42.625k u,理论等电点(p I)为6.67,推测该蛋白为酸性蛋白㊂组成白来航鸡S T I N G蛋白的20种氨基酸中,L e u 所占比例最高(17.2%),而A s n和M e t含量最低(1.3%),其中带负电荷的氨基酸(A s p和G l u) 42个,带正电荷的氨基酸(A r g和L y s)40个㊂在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30h,脂肪系数为105.01㊂S T I N G蛋白的不稳定系数为69.26,高于阈值40,表明该蛋白不稳定㊂2.2.3亲/疏水性预测白来航鸡S T I N G蛋白在第34位氨基酸处分值最高(3.500),在第257位氨基酸处分值最低(―2.789)(图4),总平均亲水性G R A V Y为―0.041,即S T I N G为亲水性蛋白㊂5731中 国 畜 牧 兽 医51卷图2 不同物种S T I N G 基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o f S T I NG g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i es 图3 基于S T I N G 基因氨基酸序列构建的系统进化树F i g .3 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do na m i n o a c i d s e qu e n c e o f S T I N G g e ne 图4 白来航鸡S T I N G 蛋白亲/疏水性预测F i g .4 H y d r o p h i l i c i t y a n dh y d r o p h o b i c i t yp r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 67314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.2.4 信号肽及跨膜区预测 白来航鸡S T I N G 蛋白不含信号肽(图5),推测该蛋白不是分泌型蛋白;该蛋白含4个跨膜区,分别位于第27―42㊁57―73㊁101―112及124―141位氨基酸处(图6),属于跨膜蛋白㊂图5 白来航鸡S T I N G 蛋白信号肽预测F i g .5 S i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t e L e gh o r n c h i c k e ns 图6 白来航鸡S T I N G 蛋白跨膜区预测F i g .6 T r a n s m e m b r a n e r e g i o n p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.5 结构域预测及亚细胞定位 预测结果显示,白来航鸡S T I N G 蛋白具有1个保守结构域T M E M 173,位于第50―342位氨基酸处㊂白来航鸡S T I N G 蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,在细胞核中合成较多,在细胞质中合成最少㊂2.2.6 修饰位点预测 白来航鸡S T I N G 蛋白丝氨酸㊁酪氨酸㊁苏氨酸磷酸化位点分别有25㊁3及5个(图7);存在43个O -糖基化磷酸位点(图8),不存在N -糖基化磷酸位点㊂图7 白来航鸡S T I N G 蛋白磷酸化位点预测F i g .7 P h o s p h o r y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 2.2.7 二级结构及三级结构预测 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)㊁延伸链(10.29%)㊁β-转角(3.43%)㊁无规则卷曲(31.66%)(图9)㊂白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构主要以α-螺旋为主(图10),与二级结构预测结果一致㊂2.2.8 蛋白互作分析 将白来航鸡S T I N G 蛋白序列导入S T R I N G12.0在线数据库,结果显示,该蛋白与N F K B 1㊁D D X 41㊁c G A S ㊁T B K 1等蛋白存在互作(图11)㊂7731中 国 畜 牧 兽 医51卷图8 白来航鸡S T I N G 蛋白O -糖基化位点预测F i g .8 O -g l y c o s y l a t i o n s i t e p r e d i c t i o no f S T I N G p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns h ,α-螺旋;e ,延伸链;t ,β-转角;c ,无规则卷曲h ,A l ph ah e l i x ;e ,E x t e n d e d c h a i n ;t ,B e t a t u r n ;c ,R a n d o mc o i l 图9 白来航鸡S T I N G 蛋白二级结构F i g .9 S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f S T I NG p r o t e i n i n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图10 白来航鸡S T I N G 蛋白三级结构F i g .10 T e r t i a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e ns 图11 白来航鸡S T I N G 蛋白互作分析F i g .11 P r o t e i ni n t e r a c t i o n a n a l y s i so fS T I NG p r o t e i ni n W h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 87314期王 艳等:白来航鸡S T I N G 基因克隆㊁生物信息学及组织表达特性分析2.3 白来航鸡S T I N G 基因组织表达分析通过实时荧光定量P C R 检测S T I N G 基因在白来航鸡14个组织中的表达情况,结果显示,S T I N G 基因在白来航鸡肺脏中的表达量最高,且显著高于其他组织(P <0.05);在胸肌中的表达量最低(图12)㊂肩标不同字母表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P >0.05)V a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n n o s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图12 S T I N G 基因在白来航鸡不同组织中的相对表达量F i g .12 T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f S T I NG g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e s o fW h i t eL e gh o r n c h i c k e n s 3 讨 论S T I N G 是固有免疫系统I F N -Ⅰ信号通路中的一个重要接头蛋白,定位在内质网上,可激活T B K I ㊁I K K ㊁I R F 3及N F -κB 通路,强烈刺激I F N -Ⅰ和白介素等免疫炎症因子的产生[11]㊂I F N -β在S T I N G 通路中分泌量最高,它不仅能够消灭癌细胞,还能通过促使树突细胞成熟实现抗原递呈,从而将固有免疫应答与获得性免疫应答相联系[12]㊂S T I N G 基因缺失使小鼠胚胎成纤维细胞(S T I N G -/-M E F s)极易受到负链病毒感染,如水疱性口炎病毒(V S V )和1型单纯疱疹病毒(H S V -1)[13]㊂本研究成功克隆白来航鸡S T I N G 基因C D S 区序列,为后期研究禽类S T I N G 蛋白抗病毒作用机制提供基础数据㊂系统进化树显示,白来航鸡与原鸡亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远,表明该基因在不同物种间保守性具有一定差异㊂白来航鸡S T I N G 蛋白为酸性㊁亲水性蛋白㊂以上结果表明该基因在不同物种的发育进化过程中表现出了种内相似性和种间差异性㊂白来航鸡S T I N G 蛋白无信号肽,说明该蛋白不是分泌蛋白,结合蛋白的亚细胞定位推测其主要存在于细胞质或线粒体中㊂另外,白来航鸡S T I N G 蛋白具有4个跨膜结构域㊂在S T I N G 二聚体中,8个T M 螺旋被分成由T M 2和T M 4组成的中间层和由T M 1和T M 3组成的外围层,其中1个S T I N G 分子的T M 1和另1个分子的T M 2㊁T M 3和T M 4被堆积在一起,形成结构域包裹的结构,这种保守的结构特征对蛋白的稳定性和功能至关重要[14]㊂白来航鸡S T I N G 蛋白存在T M E M 173保守结构域,预测结果显示其可促进先天免疫信号传导,与刘健新等[15]对山羊S T I N G 蛋白结构域的预测结果一致㊂白来航鸡S T I N G 蛋白中含有43个O -糖基化磷酸位点,这些修饰位点可能影响S T I N G 蛋白的空间构象㊁合成㊁运输㊁定位等生物过程,不存在N -糖基化磷酸位点,从而对该蛋白的不稳定性产生影响㊂S T I N G 蛋白共有33个潜在磷酸化位点,该蛋白本身的磷酸化是下游信号转导所必需的,其中含有的2个保守的丝氨酸和苏氨酸位点是T B K 1的磷酸化靶点㊂另外,S T I N G 磷酸化有助于其从细胞质到高尔基体的适当易位,开启免疫反应,且还参与防止S T I N G 过度激活和维持体内平衡[16]㊂蛋白质棕榈酰化是一种功能强大且保守的翻译后修饰,脂肪酸链通过可逆的硫酯键与蛋白质的半胱氨酸残基连接[17]㊂在高尔基体中,S T I N G 的2个半胱氨酸残基(C ys 88和9731中国畜牧兽医51卷C y s91)被棕榈酰化,激活其下游信号通路,这是S T I N G激活所必需的翻译后修饰[18]㊂蛋白互作预测结果显示,S T I N G蛋白与N F K B1㊁D D X41㊁c G A S㊁T B K1等蛋白存在相互作用㊂S T I N G蛋白可与c G A S结合形成第二信使c G A M P,使得S T I N G招募并激活T B K1,进而诱导I F N-Ⅰ和其他调节因子[19]㊂研究表明,当树突状细胞在感染H S V-1或腺病毒后,D D X41与S T I N G直接相互作用介导T B K1㊁N F-κB和I R F3的激活[20]㊂推测S T I N G 通过与这些蛋白互作,从而参与免疫及抗病毒过程㊂通过对白来航鸡S T I N G基因的组织表达特性分析可知,S T I N G基因的分布具有组织特异性,其中在肺脏中表达量最高,而石树端等[21]研究发现鸭S T I N G基因在腺胃中表达水平最高,表明家禽中m R N A组织分布存在一定差异;其次是脾脏,提示S T I N G基因广泛分布于宿主的免疫器官;此外, S T I N G基因在回肠㊁十二指肠等肠道组织中也有表达,因为肠道中的微生物菌群是启动免疫的重要因子,肠道微生物与宿主的互作建立机体的适应性免疫系统,可有效维持免疫防御作用[22];在胸肌中表达量最低,与金洁[7]研究结果一致㊂研究表明, S T I N G基因表达量降低可以提示肝癌和胃癌患者的预后不良[23-24],而注射S T I N G激动剂可使人乳头瘤病毒相关肿瘤组织消退[25]㊂另外,通过抑制S T I N G通路可以阻断衰老细胞释放促炎信号,从而改善老年神经退行性疾病[26]㊂因此,抑制或激活S T I N G信号通路,可为疾病治疗提供新的途径和特异性治疗靶点[21]㊂本试验通过对白来航鸡S T I N G 基因编码蛋白进行生物信息学和组织表达特性分析,为揭示S T I N G基因在固有免疫系统中的作用提供数据,并为后期探究S T I N G编码蛋白的生物学功能提供切实的理论基础㊂4结论本研究成功克隆了白来航鸡S T I N G基因C D S 区序列,大小为1140b p,编码379个氨基酸㊂白来航鸡与原鸡的亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远㊂S T I N G蛋白属于酸性㊁亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽,主要在细胞质和线粒体中发挥作用㊂S T I N G基因在白来航鸡肺脏中表达量最高,在胸肌中表达最低㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G U O Y,J I A N GF,K O N G L,e t a l.O T U D5p r o m o t e si n n a t e a n t i v i r a l a n d a n t i t u m o r i m m u n i t y t h r o u g hd e u b i q u i t i n a t i n g a n ds t a b i l i z i n g S T I N G[J].C 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杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2024(37)1【摘要】【目的】研究UGT198基因是否参与调控烟草抗虫性,为未来探索其参与调控杨树抗虫性奠定基础。
【方法】前期通过分析公共转录组数据发现PtrUGT198基因在杨树响应虫害的转录组中高调表达,对其进行生物信息学及进化分析。
以107杨为材料,克隆UGT198基因,构建过量表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草获得过量表达转基因株系。
通过棉铃虫饲虫试验初步验证UGT198基因是否参与调控抗虫性,分析UGT198基因在调控抗虫性中发挥的功能。
【结果】PtrUGT198基因完整的ORF区为1440 bp,编码479个氨基酸,理论分子量为53.14 kDa,等电点为5.92,编码不稳定疏水性蛋白。
PtrUGT198蛋白的二级结构α⁃螺旋占41.75%,β⁃折叠占14.61%,β⁃转角占7.10%,无规卷曲占6.53%。
PtrUGT198蛋白不存在跨膜区,预测其不属于膜蛋白,为非分泌性蛋白,该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。
同源序列对比结果显示PtrUGT198蛋白的C末端存在高度保守的植物次生产物糖基转移酶(Plant secondary product glycosyltransferase,PSPG)基序。
系统进化树分析发现,PtrUGT198蛋白与同属植物毛白杨、银白杨和胡杨亲缘关系最近,其次和模式植物烟草有较近的亲缘关系。
成功克隆杨树UGT198基因,构建pNC⁃UGT198基因过量表达载体,并转化烟草获得过量表达转基因株系,进行饲虫实验,得到高表达量烟草相对抗虫。
【结论】首次成功克隆了UGT198基因,并初步解析其调控抗虫性的功能,为深入了解UGT198基因调控杨树抗虫机理提供参考价值。
【总页数】9页(P14-22)【作者】杨改霞;王春雨;龙连香;王世杰;顾丽姣【作者单位】河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S72【相关文献】1.小麦VP基因的克隆、生物信息学分析及功能初探2.杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析3.运用基因组和EST数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略4.陆地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息学分析及功能初探因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
《甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因的克隆及其在果实发育中功能的初步分析》篇一一、引言随着现代生物学技术的快速发展,基因克隆及其功能分析在农业领域,尤其是作物改良方面具有重要意义。
甜瓜作为一种重要的经济作物,其果实发育过程中涉及到的基因调控机制成为研究的热点。
本篇论文主要围绕甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因的克隆及其在果实发育中的功能进行初步分析,以期为甜瓜的遗传改良和品质提升提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料本实验以甜瓜为研究对象,采集不同发育阶段的甜瓜果实样品,用于基因克隆及表达分析。
2. 方法(1)基因克隆:利用PCR技术,从甜瓜基因组DNA中扩增出CmHBⅡ-1及CmFER10基因。
(2)序列分析:对克隆得到的基因序列进行测序和生物信息学分析。
(3)表达分析:通过实时荧光定量PCR技术,分析CmHBⅡ-1及CmFER10基因在甜瓜果实不同发育阶段的表达情况。
三、结果与分析1. 基因克隆结果通过PCR扩增,成功克隆出甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因。
序列测定结果表明,这两个基因的序列长度分别为X碱基对和Y碱基对,与已知的基因序列高度相似。
2. 生物信息学分析对克隆得到的基因序列进行生物信息学分析,结果表明CmHBⅡ-1和CmFER10分别属于HB和FER基因家族,具有典型的结构域和保守序列。
这为进一步研究这两个基因的功能提供了依据。
3. 表达分析结果实时荧光定量PCR结果显示,CmHBⅡ-1及CmFER10基因在甜瓜果实发育过程中表达量存在显著差异。
在果实发育的早期和中期,这两个基因的表达量较高,而在果实成熟期表达量降低。
这表明这两个基因可能参与调控甜瓜果实的发育过程。
四、讨论本实验成功克隆了甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因,并通过生物信息学分析和表达分析,初步探讨了这两个基因在甜瓜果实发育中的功能。
结果表明,这两个基因可能参与调控甜瓜果实的发育过程,并在果实发育的早期和中期发挥重要作用。
《‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》篇一西伯利亚百合LiCMK基因克隆及功能分析一、引言西伯利亚百合(Lilium sibiricum)作为一种珍贵的花卉植物,其生长环境和遗传特性吸引了众多科学家的关注。
近年来,随着分子生物学和基因克隆技术的快速发展,关于西伯利亚百合的基因研究也日益深入。
本文旨在介绍西伯利亚百合中LiCMK基因的克隆及其功能分析,为进一步了解该基因的功能及其在植物生长和抗逆性中的作用提供理论基础。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的西伯利亚百合材料采自自然环境下的野生种群,经过分子生物学技术提取其基因组DNA和RNA。
2. 方法(1)基因克隆:通过PCR技术扩增LiCMK基因的cDNA序列,将目的片段与载体连接后转化至大肠杆菌中,筛选阳性克隆并进行测序验证。
(2)功能分析:采用生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析,预测其编码的蛋白质结构和功能;通过构建过表达和沉默载体,分别在植物中实现LiCMK基因的过表达和沉默,观察其对植物生长和抗逆性的影响。
三、实验结果1. LiCMK基因的克隆通过PCR技术成功扩增出LiCMK基因的cDNA序列,与载体连接后转化至大肠杆菌中,经过筛选得到阳性克隆并进行测序验证,确认序列的正确性。
2. LiCMK基因的序列分析通过生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析,发现该基因编码一个具有特定功能的蛋白质。
进一步分析表明,该蛋白质具有跨膜结构和保守的蛋白结构域,可能参与植物的生长和抗逆性等生物学过程。
3. LiCMK基因的功能分析(1)过表达实验:将LiCMK基因构建成过表达载体并转化至植物中,观察其对植物生长的影响。
结果显示,过表达LiCMK 基因的植物表现出更强的生长能力和抗逆性。
(2)沉默实验:通过RNA干扰技术实现LiCMK基因的沉默,观察其对植物生长和抗逆性的影响。
结果显示,沉默LiCMK 基因的植物生长受阻,抗逆性减弱。
铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析
铁皮石斛(Dendrobium officinale)是一种具有药用价值的兰
科植物,其主要功效之一是具有抗衰老的作用。
RCA2是铁皮石斛中
的一个重要基因,通过克隆该基因并进行生物信息学分析可以深入
研究铁皮石斛的生理功能及代谢途径。
铁皮石斛RCA2基因的克隆可以采用PCR扩增、文库筛选等方法。
首先需要设计引物,根据已报道的相关物种中的RCA2基因序列进行
进化比对,选择高保守性的区域设计特异性引物。
然后,利用铁皮
石斛的基因组DNA或cDNA作为模板,进行PCR扩增,得到目标
RCA2基因的DNA序列。
将PCR产物进行序列分析,确认其序列正确性。
生物信息学分析可以对铁皮石斛RCA2基因的序列进行预测和分析,包括基因注释、基因结构分析、启动子分析、功能域分析、进
化比对等。
其中,基因结构分析可以预测基因的外显子和内含子区域,有助于了解该基因的转录和翻译机制;启动子分析可以预测基
因的调控元件和转录因子结合位点,有助于了解该基因调控机制;
功能域分析可以预测基因中的特定结构域和功能区,有助于了解该
基因的功能;进化比对可以将铁皮石斛的RCA2基因与其他物种的同
源基因进行比对,了解该基因的进化历程和功能演化。
通过铁皮石斛RCA2基因的克隆和生物信息学分析,可以深入研
究其生理功能及代谢途径,为铁皮石斛的药用开发和利用提供科学
依据。
生物信息学中的基因功能分析技术引言生物信息学是将计算机科学和生物学相结合的交叉学科,致力于收集、存储、管理和分析大量的生物信息数据。
在过去的几十年中,随着DNA测序技术的快速发展和计算能力的提升,生物信息学已经成为研究基因功能的重要工具。
本文将讨论生物信息学中的基因功能分析技术,包括基因注释、基因本体论和基因互作网络分析等。
一、基因注释基因注释是生物信息学中的重要步骤之一,它通过将DNA或RNA序列与已知的基因数据库进行比对,来确定该序列所对应的基因的功能和特征。
在基因注释过程中,主要涉及到两个方面的信息:基因功能预测和基因变异分析。
1. 基因功能预测基因功能预测是根据DNA或RNA序列的特征和结构信息,来预测该基因的功能。
这可以通过比对已知基因数据库中具有相似序列的基因来实现。
目前常用的基因功能预测软件包括BLAST、HMMER和InterProScan等。
此外,还可以利用基因组学和蛋白质组学的方法来预测基因的功能,如基因组学注释和结构预测技术。
2. 基因变异分析基因变异分析是研究基因序列中的突变和多态性等变异情况,以了解这些变异对基因功能的影响。
在基因变异分析中,常常使用数据库中的已知基因变异信息进行比对和注释。
此外,还可以利用SNP分析、基因组上的重排分析和表型基因关联研究等技术来进行基因变异分析。
二、基因本体论基因本体论是一种描述基因功能和关系的标准化方法,它将基因的功能和生物过程以及细胞组分之间的关系进行分类和归纳。
基因本体论的主要作用是提供一个一致的标准,使得不同研究中的基因功能可以进行比较和整合。
基因本体论的核心是基因本体,它是一个由谓词关系组成的有向无环图。
基因本体分为三个主要部分:分子功能、细胞组分和生物过程。
其中,分子功能描述基因所编码的蛋白质的功能和活性;细胞组分描述蛋白质在细胞中的定位;生物过程描述基因参与的生物学过程和代谢途径。
基因本体论的优势在于提供了一种标准化的描述和分类基因功能的方法,为基因功能的研究提供了方便和便捷。
山羊肌生成抑制素(MSTN)基因的克隆及生物信息学分析金鑫燕【摘要】试验对山羊肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因序列进行了克隆及生物信息学分析,旨在为该基因的深入研究提供理论依据.结果表明,山羊MSTN基因序列长1128 bp,编码375个氨基酸,GenBank登录号为GU183368.山羊MSTN蛋白序列与绵羊、猪、兔、马、人、牛、鼠同源性依次为93%、89%、88%、88%、88%、87%、85%,同源性较高,说明该基因高度保守;疏水性分析结果表明,该蛋白大多数氨基酸为疏水性氨基酸;蛋白跨膜结构及方向显示,从内向外和从外向内分别含有1个强跨膜螺旋区;信号肽预测显示,信号肽序列长度为70;亚细胞定位预测发现,该蛋白是一个Ⅱ型膜蛋白,大部分定位于高尔基体、质膜和内质网膜,内质网腔内也有少量分布;结构功能域预测发现N-肉豆蔻酰化位点3个,N端糖基化位点2个,蛋白激酶C磷酸化位点5个,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点5个,络氨酸激酶磷酸化位点1个,EF-hand钙结合结构域1个,亮氨酸拉链1个,TGF家族标记1个;二级结构预测显示,α螺旋占25.33%,β折叠占3.20%,随机卷曲占50.13%,延伸链占21.33%.%In this article, myostatin (MSTN)gene of goat were cloned and bioformatics analysis were studied to provide theoretical reference for further research. The results showed that the length of MSTN gene was 1128 bp which encoding 375 amnio acid,and GenBank accession number was GU183368. MSTN protein sequence of goat had highly homology compared with sheep, pig, rabbit, horse, human, bovin,which was93%,89%,88% ,88%,88% ,87% and 85%, respectively. The gene had highly conservation; hydrophobic analysis showed that most amino acid were hydropathicity amino acids; protein transmem-brane helices analysisshowed that there were one transmembrane helices each in inside to outside helices and outside to inside helices; signal peptide analysis showed that signal peptide sequence length was 70;protein localization sites prediction showed that it was a type II membrane protein and most of the protein located in golgi body, plasma membrane and endoplasmic reticu-lum membrane,some in endoplasmic reticulum. The structure and function domain forecasting showed that there were 3 N-myristoylation site,2 N-glycosylation site, 5 protein kinase C phosphorylation site, 5 casein kinase Ⅱ phosphorylation site,l tyrosine kinase phosphorylation site, 1 EF-hand calcium-binding domain, 1 leucine zipper pattern, and 1 TGF-beta family signature. Secondary structure predictions showed that there were 25. 33% alpha helix,3. 20% beta turn,50. 13% random coil, 21. 33% extended strand.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)009【总页数】4页(P111-114)【关键词】山羊;MSTN基因;克隆;生物信息学【作者】金鑫燕【作者单位】青海省畜牧兽医科学院,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】Q78肌肉细胞分化、生长是由一些正向调控因子和负向调控因子进行双向调节。
《甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因的克隆及其在果实发育中功能的初步分析》篇一摘要:本文报告了甜瓜(Cucumis melo)中两个重要基因CmHBⅡ-1和CmFER10的克隆过程,并对其在果实发育过程中的功能进行了初步分析。
通过生物信息学手段及实验验证,揭示了这两个基因在甜瓜果实发育过程中的潜在作用。
一、引言甜瓜作为重要的经济作物,其果实发育和品质的形成一直是研究的热点。
近年来,随着分子生物学技术的发展,基因克隆和功能分析成为了研究果实发育机制的重要手段。
本研究的目的是克隆甜瓜中两个关键基因CmHBⅡ-1和CmFER10,并对其在果实发育中的功能进行初步分析。
二、材料与方法1. 材料实验所用的甜瓜材料为优质栽培品种,取自本实验室的种植园。
实验过程中还使用了各种分子生物学试剂和工具。
2. 方法(1)基因克隆:采用PCR技术,结合RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)和数据库比对方法,成功克隆了CmHBⅡ-1和CmFER10基因的全长cDNA序列。
(2)生物信息学分析:利用生物信息学软件对克隆得到的基因序列进行注释和分析。
(3)功能分析:通过转基因技术和实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,对CmHBⅡ-1和CmFER10在甜瓜果实发育过程中的功能进行了初步分析。
三、结果与分析1. 基因克隆成功克隆了甜瓜中的CmHBⅡ-1和CmFER10基因的全长cDNA序列。
这两个基因的编码区序列完整,无突变或缺失。
2. 生物信息学分析(1)CmHBⅡ-1基因编码一个含有bHLH(basic helix-loop-helix)结构域的蛋白,该蛋白在植物生长发育中具有重要作用。
(2)CmFER10基因编码一个与果糖转运相关的蛋白,可能参与果实的糖分积累和转运过程。
3. 功能分析(1)通过转基因技术,将CmHBⅡ-1基因在模式植物中过表达,发现过表达植株的果实发育相关表型发生了明显变化,表明该基因在甜瓜果实发育中具有重要作用。
植物抗病基因的克隆与功能分析在农业生产中,植物病害一直是影响农作物产量和质量的重要因素之一。
为了有效地防治植物病害,科学家们致力于研究植物的抗病机制,并对植物抗病基因进行克隆和功能分析。
这一研究领域的不断深入,为开发新的抗病品种和制定更有效的病害防治策略提供了重要的理论基础和技术支持。
植物抗病基因的克隆是研究其功能的前提。
克隆植物抗病基因的方法多种多样,其中最常用的是图位克隆法。
这种方法首先需要构建一个包含大量个体的遗传群体,然后通过对这些个体的抗病性表现和遗传标记进行分析,逐步将抗病基因定位在染色体的特定区域。
接着,通过精细定位和测序,最终确定抗病基因的序列。
除了图位克隆法,还有基于同源序列的克隆法。
许多抗病基因在结构和功能上具有一定的相似性,因此可以根据已知抗病基因的序列设计引物,从待研究的植物中扩增出同源序列,再通过进一步的分析和验证来确定是否为真正的抗病基因。
还有一种比较新的方法是基于转录组测序的克隆法。
通过对植物受到病原菌侵染前后的转录组进行测序和分析,可以筛选出在侵染过程中表达量显著变化的基因,这些基因很可能与抗病反应有关,进而从中鉴定出抗病基因。
成功克隆出植物抗病基因后,接下来的关键任务就是对其功能进行分析。
这通常包括对基因的表达模式、编码蛋白的结构和功能以及在抗病反应中的作用机制等方面的研究。
在研究基因表达模式时,常用的技术有实时荧光定量 PCR 和 RNA 原位杂交等。
通过这些技术,可以了解抗病基因在不同组织、不同发育阶段以及在受到病原菌侵染后的表达情况。
比如,有些抗病基因在叶片中高表达,而有些则在根部特异性表达;有些抗病基因在病原菌侵染早期就迅速被激活,而有些则在后期发挥作用。
对于编码蛋白的结构和功能分析,通常会采用生物信息学的方法对其氨基酸序列进行预测和分析,确定其可能的结构域和功能位点。
同时,还可以通过体外表达和纯化蛋白,进行酶活性测定、蛋白质互作等实验,进一步明确其功能。
青杄PsbO基因cDNA序列克隆及⽣物信息学分析OEE1(oxygen -evolving enhancer protein 1,MSP,33kD 蛋⽩)是由核基因锰簇稳定外周蛋⽩PsbO 基因编码的定位于叶绿体的33kD 蛋⽩,结合在类囊体膜内的光系统Ⅱ的外缘,是与放氧关系最为密切的外周蛋⽩,在维持光系统Ⅱ复合体的稳定⽅⾯发挥重要作⽤[1].⾃从Yamamoto 等第⼀次从光系统Ⅱ膜上纯化出OEE1蛋⽩之后[2],对该蛋⽩以及编码该蛋⽩的PsbO 基因的研究⼀直都未停⽌过.光合系统是对外界逆境响应最为敏感的部分,极易引发产⽣活性氧,造成光合系统破坏,出现光抑制情况.Mn 簇是否稳定对光系统Ⅱ光抑收稿⽇期:2012-02-24;修回⽇期:2012-03-29基⾦项⽬:国家转基因⽣物新品种培育科技重⼤专项资助项⽬(2009ZX08009-062B )作者简介:刘亚静(1987-),⼥,河北衡⽔⼈,硕⼠研究⽣,主要从事植物抗逆基因的克隆和功能研究,E -mail :liuyajing1987@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html ;*通讯作者:张凌云(1973-),⼥,北京林业⼤学森林培育学科副教授,主要从事植物发育与⽣殖⽣物学研究,E -mail :lyzhang73@/doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html .青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析刘亚静,李长江,孙帆,张凌云*(北京林业⼤学森林培育与保护教育部重点实验室,中国北京100083)摘要:利⽤RACE 技术从已有的青杄均⼀化cDNA ⽂库中克隆得到青杄(Picea wilsonii )PsbO 基因cDNA 的全长,并⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA 的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋⽩PwPsbO 的理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构,PwPsbO 基因进化树等进⾏了预测和分析.采⽤实时荧光定量PCR (RT -qPCR )技术,测定了青杄不同组织中的PsbO 基因的相对表达⽔平.结果发现:青杄PsbO 基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29,属于可溶性蛋⽩.⼆级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT -qPCR 发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最⾼.这些结果为青杄中PsbO 基因的初步功能研究奠定了基础.关键词:青杄;PsbO 基因;RACE ;⽣物信息学中图分类号:Q781⽂献标识码:A⽂章编号:1007-7847(2012)03-0201-06cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of PsbO Genefrom Picea wilsoniiLIU Ya -jing,LI Chang -jiang,SUN Fan,ZHANG Ling -yun *(Key laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education,Beijing Forestry University,Beijing100083,China )Abstract :Full -length cDNA sequence of PsbO gene was acquired from normalized cDNA library of Piceawilsonii by RACE methods.Prediction on physical and chemical properties,hydrophobicity,phylogenetic tree ,secondary and tertiary structure of amino acid were analyzed by bioinformatics.The relative expression level of PwPsbO in different tissues using quantitative real time PCR (RT -qPCR)was measured.The results showed that PwPsbO gene encodes 346aminoacids.Its molecular weight is 36.6kD and the theoretical pI is 5.29.It is a hydrophilic protein.The secondary and tertiary structure of PwPsbO is mainly composed of alpha helix,random coil and extended strand.The higher expression level of PwPsbO was observed in needles and stems.The aim of this study is to lay a foundation for the function of PsbO in Picea wilsonii .Key words :Picea wilsonii ;PsbO ;RACE ;bioinformatics(Life Science Research ,2012,16(3):201~206)第16卷第3期⽣命科学研究Vol.16No.32012年6⽉Life Science ResearchJun.2012⽣命科学研究2012年制产⽣活性氧的过程会产⽣重要影响.PsbO可能直接影响Cl-在光系统Ⅱ放氧反应中与活性位点的结合或者作⽤的发挥[3].将PsbO蛋⽩从膜上去除会导致在低Cl-浓度下Mn簇4个Mn原⼦中的2个从膜上脱落[4].另有许多证据表明PsbO 蛋⽩与CP47之间存在结合,保护CP47免受限制性蛋⽩酶的降解,去除PsbO蛋⽩以后,CP43、Cytb559的α亚基易被胰蛋⽩酶剪切[4,5].拟南芥的PsbO2涉及在⾼光条件下调节D1蛋⽩的运转,具有维持光系统Ⅱ的功能[6].因此,OEE1蛋⽩很有可能参与光合放氧⽣物在光照胁迫时的保护机制[5,7].杨传平等应⽤SSH技术研究盐胁迫下柽柳相关基因的表达情况,获得了36个盐胁迫响应基因,其中就包括PsbO蛋⽩基因[8].Sugihara K等发现⽊榄在500mmol/L NaCl胁迫下OEE1蛋⽩表达的表达增强[9].这些研究表明PsbO蛋⽩很可能参与逆境条件下的胁迫响应过程.最近,有关⼈员预测PsbO蛋⽩可能也发挥包括酶活性调节、反应中⼼蛋⽩翻转的调控、类囊体膜结构的调整等功能[10,11],这可能预⽰着PsbO在其它更多⽅⾯的新功能的发现.本⽂以青杄为研究对象,成功克隆得到青杄中PsbO基因的全长cDNA,利⽤⽣物信息学的⽅法对该cDNA核苷酸序列、氨基酸序列的相似性、理化性质、亲⽔性/疏⽔性、⼆级和三级结构、进化树等进⾏了预测和分析,并⽤RT-qPCR⽅法分析了PsbO基因在青杄不同组织中的相对表达⽔平,旨在为进⼀步进⾏PsbO基因的功能研究奠定科学基础.1材料与⽅法1.1实验材料多年⽣青杄(Picea wilsonii)的花粉和针叶,由中科院植物所北京植物园提供.供试花粉于室温下⾃然风⼲,贮藏于-20℃冰箱.供试针叶⽤液氮速冻,贮藏于-80℃超低温冰箱.⽤Gateway技术构建青杄cDNA⽂库,由英俊⽣物公司构建.两年⽣青杄的根、茎、叶⽤于进⾏RT-qPCR实验.Taq DNA聚合酶、DL2000购买于中国TAN-GENG公司,pDONR222载体购买于美国Invitro-gen公司,反转录试剂盒购买于加拿⼤Fermentas 公司,荧光定量PCR试剂盒购买于美国KAPA公司,pEASY-T1购买于中国全式⾦公司,其它试剂均购于美国Promega公司.1.2实验⽅法1.2.1利⽤RACE PCR获取PwPsbO基因的末端序列以多年⽣青杄cDNA⽂库(本实验室已构建)为模板,利⽤PsbO的EST序列中特异引物与PDONR222两端的载体引物进⾏5′-RACE与3′-RACE实验.5′-RACE实验利⽤上游引物5PR-L 与下游引物5PR-R(见表1),3′-RACE实验利⽤上游引物3PR-L与下游引物3PR-R(见表1)进⾏扩增.通过EST⽚端与5′端、3′端序列的拼接,得到PsbO基因的全长cDNA序列.1.2.2PwPsbO基因的⽣物信息学分析利⽤DNAMAN软件进⾏PwPsbO的cDNA 序列编码框预测及蛋⽩翻译.通过NCBI(http:///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)与TRIR(http:///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /)⽹站中的BLASTn与BLASTp⼯具进⾏核酸序列与蛋⽩序列的同源性分析,⽤CLUSTALX软件进⾏多序列⽐对,⽤MEGA5进⾏系统树的构建;利⽤ExPASy(http:///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /tools/)中的Compute pI/Mw⼯具(http:// /doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /compute_pi/)预测其等电点和相对分⼦质量,利⽤ProtScale⼯具(http:///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱;利⽤TMHMM⼯具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM-2.0/)预测蛋⽩是否跨膜;利⽤SWISS-MODEL ⼯具来预测蛋⽩的⼆级和三级结构.1.2.3利⽤RT-qPCR进⾏PwPsbO基因的组织表达分析利⽤Aidlab公司RNA提取试剂盒提取两年⽣青杄的根、茎、叶与多年⽣青杄的种⼦和花粉的RNA.利⽤Fermentas公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA.根据PwPsbO的CDS设计特异引物QRT-L、QRT-R(见表1).选⽤青杄EF-1α基因为内参基因,并设计引物EF-1α-L和EF-1α-R(见表1).利⽤KAPA公司的SYBR FAST qPCR Kit(ABI prismTM)在ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进⾏RT-qPCR 实验,分析PwPsbO在青杄5种不同组织中的相对表达情况.2结果2.1通过RACE实验获取PwPsbO的cDNA全长对5′RACE和3′RACE实验获取的⽚段进⾏202第3期刘亚静等:青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析图1PwPsbO 的核苷酸序列和氨基酸序列氨基酸序列⽤单个字母表⽰,下划线标记为转录起始密码⼦ATG 和转录终⽌密码⼦TGA ;氨基酸碳末端⽤星号表⽰,PolyA 信号⽤⿊体表⽰.Fig.1Nucleotide sequences and deduced sequence of a -mino acid residues of PwPsbOThe amino acid residues are indicated by a single letter code.A potential translation initiation codon (ATG)and a termination codon are underlined ;the C terminal of se -quence of amino acid residues is marked with asterisk ;the potential polyadenylation signal sites are marked inbold.测序,并且将测序结果与EST ⽚段拼接获取cDNA 全长(图1).设计引物PsbO -L 与PsbO -R,⽤PCR 扩增PwPsbO 的编码区,将⽚段连接pEASY -T1载体上酶切和测序进⾏鉴定.2.2PwPsbO 的氨基酸组成与理化性质分析应⽤DNAMAN 对PwPsbO 的全长cDNA 序列进⾏分析发现:PwPsbO 的全长cDNA 共1260bp,在54bp 出现起始密码⼦ATG,在1092bp 处发现终⽌密码⼦TGA,在1248bp 处出现PolyA 尾巴,编码区由1041bp 核酸组成,编码346个氨基酸(核苷酸和氨基酸序列见图1).应⽤Compute pI/Mw ⼯具预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI 值为5.29.2.3PwPbsO 推导的氨基酸序列的的疏⽔/亲⽔性分析氨基酸的疏⽔性和亲⽔性是氨基酸的固有特性,蛋⽩结构的稳定性在很⼤程度上依赖于氨基酸的疏⽔特性.我们利⽤ProtScale ⼯具(http :///doc/8a553b4e83c4bb4cf6ecd17c.html /protscale/)计算蛋⽩的疏⽔性图谱,对PwPbsO 蛋⽩的疏⽔性和亲⽔性进⾏了分析.发现第159位的赖氨酸(Lys )、160位天冬酰胺酸(Asn )、163位的脯氨酸(Pro )疏⽔性最差是-2.467,79位的丙氨酸(Ala )疏⽔性最强是2.256.⼤部分的氨基酸属于亲⽔性氨基酸,因此预测PwPbsO 为可溶性蛋⽩(见图2).2.4PwPsbO 基因与多种植物的序列⽐对及系统进化树分析我们将PwPsbO 蛋⽩的氨基酸序列与拟南芥、⽟⽶、杨树、⽊榄、⽑⽵、葡萄等物种(表2)的序列进⾏了多序列⽐对,发现PwPsbO 蛋⽩和其他PsbO 蛋⽩类似,含有较多的α螺旋以及β折叠结构[12](图3).并⽤MEGA5进⾏了系统树的构建(图4).结果发现,青杄PsbO 基因和⽑⽵、⽟⽶的亲缘关系最近.2.5PwPsbO 的⼆、三级结构分析我们利⽤GOR4在线⼯具做了PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测,发现该氨基酸序列含有23.99%的α螺旋结构(Alpha helix),21.97%的β折叠(Extended strand ),54.05%的随机卷曲(Random coil ),这个结果(见图5)和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.应⽤SWISS -MODEL ⼯具来预测PwPsbO 蛋⽩的三维结构也得到了类似的结果(图6).表1cDNA 克隆和RT -qPCR 所⽤引物序列Table 1The primers used in the cDNA cloning andRT -qPCRPrimers 5PR -L 5PR -R 3PR -L 3PR -R QRT -L QRT -R EF -1α-L EF -1α-R PsbO -L PsbO -RSequencesCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA CAGCGCGGATCCTGTTGCGAGG CCTCGCAACAGGATCCGCGCTG CTGCCAGGAAACAGCTATGAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG AAGGCCCTTGAGAGGTTCGAGG AACTGGAGAAGGAACCCAAG AACGACCCAATGGAGGATAC ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG TCAATTTGTGCATACCATGGG203⽣命科学研究2012年图3不同植物的PsbO 蛋⽩多序列⽐对结果Fig.3The multiple protein sequences alignment result表2PwPsbO 的同源基因Table 2Homological genes of PwPsbO图2PwPsbO 蛋⽩的疏⽔性分析图谱Fig.2Hydrophobic analysis of PwPsbOProtScale output for user sequenoe2.52.01.51.00.5-0.50-1.0-1.5-2.0-2.5S c o r ePosition50100150200250300Hphob./Kyte &DoolittleSpeciesArabidopsis thanliana Populus trichocarpa Bruguiera gymnorhiza Zea maysPhyllostachys edulis Vitis viniferaNicotiana benthamianaAccession AT5G66570AT3G50820XP_002310188AB043960ACG31595ABV57472XP_002274796AAX53163 Gene AtPsbO 1AtPsbO 2PtPsbO BgPsbO ZmPsbO PePsbO VvPsbO NbPsbO 1E value e -126e -125003e -1802e -9700204第3期图8PwPsbO 基因在两年⽣青杄的相对表达情况Fig.8Transcript accumulation of PwPsbO in 2-year -old trees图7青杄各组织RNA 提取结果Fig.7The result of RNA of five tissues in Picea wilsonii图6由SWISS -MODEL ⼯具预测的PwPsbO 蛋⽩的三级结构Fig.6The tertiary structure of protein PwPsbO present -ed by SWISS -MODEL图4不同植物间PbsO 基因系统树Fig.4Polygenetic tree of PbsO about 8kinds of differ -ent plantsBgOEP1NbPSBO1VvPSBO1AtPSBO1AtPSBO2PwPSBO1ZmOEP1PePSBO0.0250100150200250图5PwPsbO 蛋⽩的⼆级结构预测图紫⾊代表随机卷曲,红⾊代表α螺旋结构,蓝⾊代表β折叠.Fig.5The secondary structure of protein PwPsbO presented by GOR4The part of purple/red/blue represent the random coil/alpha helix/extended strand. 28S 18Srootstemneedlespollenseedrootstemneedles pollenseed0.51.01.52.02.53.03.5R e l a t i v e e x p r e s s i o n2.6PwPsbO 基因在不同组织中的表达情况分别提取青杄根、茎、叶、花粉、种⼦5种组织的总RNA.经过1.2%琼脂糖凝胶电泳(110V,15min),18S 和28S 条带明显(图7).接下来我们对所提取的RNA 进⾏OD 260/280检测分析,OD 值⼤⼩介于1.8~2.0之间,说明提取的总RNA 纯度⽐较好,可以⽤于后续实验.将上⼀步提取的各组织RNA 通过加拿⼤Fermentas 公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 合成双链cDNA 试剂盒反转录为cDNA.利⽤KAPA 公司的SYBR FAST qPCR Kit (ABI prism TM )在ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪进⾏RT -qPCR 实验.设置阴性对照和空⽩对照,每次试验设置3个重复,得到PsbO 基因在不同组织中表达情况的RT -qPCR 的结果(图8).结果显⽰,PsbO 基因在青杄的茎和叶中的表达量最⾼.3结论与讨论以青杄cDNA ⽂库为模板的RACE 实验是基于EST 保守序列和pDONR222载体上特异的引物进⾏的,因此cDNA 全长是由PsbO 的末端序列和EST 序列进⾏拼接⽽来的,进⽽完成基因的克隆.本研究成功获得了青杄PsbO 基因的cDNA 序列并推导出了它的氨基酸序列.青杄PsbO 基因的全长cDNA 共1260bp,包括1041bp 的完整的53bp 的5′⾮翻译区(5′site untranslated re -gion,5′-UTR),368bp 的3′⾮翻译区(3′-UTR)以及刘亚静等:青杄PsbO 基因cDNA 序列克隆及⽣物信息学分析205⽣命科学研究2012年poly(A)尾巴.青杄PsbO基因编码346个氨基酸,预测相对分⼦质量为36.6kD,理论pI值为5.29.青杄PsbO蛋⽩的⼆级结构预测表明此蛋⽩含有23.99%的α螺旋结构(alpha helix),21.97%的β折叠结构(extended strand),54.05%的随机卷曲结构(random coil),三级结构以⽆规则卷曲为主,α螺旋和β折叠主要分布在PsbO蛋⽩的外围.三级结构中形成了⼀个圆桶形的结构域,可以推测锰离⼦在该区域螯合.这个结果和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.⽬前已有研究使⽤⼩⾓度的X射线观测了低分辨率下野⽣型菠菜PsbO蛋⽩.该蛋⽩在溶解状态时以单分⼦状态存在[13].这也和本研究预测的Pw-PsbO蛋⽩为可溶性蛋⽩⼀致.最新的研究表明psbo突变植物的光合系统Ⅱ放氧复合体的稳定性存在多样缺陷.真核⽣物中的PsbO蛋⽩可能通过与锰离⼦、钙离⼦以及氯离⼦的联系影响光系统Ⅱ放氧过程的氧化还原反应[14].⽬前已经在拟南芥、⽔稻、⼩麦、菠菜、烟草、番茄等许多植物中发现PsbO基因具有多个拷贝的现象,这说明PsbO在响应⾼光胁迫过程中,可能存在⼀种通过调控D1蛋⽩周转达到提⾼植物抗性的机制,⽽且有关研究也发现某些逆境条件上调PsbO基因的表达,表明PsbO基因可能在提⾼植物抗逆性⽅⾯具有⼀定的作⽤.我国特有树种青杄(Picea wilsonii)是⼀种品质⾮常优良的树种,性强健、适应⼒强、耐阴性强、耐寒性强,PsbO基因是否在逆境响应中发挥作⽤,还需要进⼀步研究.本研究⾸次从中国特有树种青杄中克隆得到了PwPsbO基因的cDNA全长,并应⽤⽣物信息学的⽅法初步预测了该基因的⼀些性质和结构⽅⾯的特征,这对继续研究PwPsbO如何保持光系统Ⅱ的稳定性以及在逆境胁迫响应中的功能等⽅⾯具有⼀定的意义.参考⽂献(References):[1]于勇,翁俊,徐春和.植物光系统Ⅱ放氧复合体外周蛋⽩结构和功能的研究[J].植物⽣理学报(YU Yong,WENG Jun,XU Chun-he.The progress in the investigation on the structure and function of the extrinsic proteins of photosystem II[J].Acta Phytophysiologica Sinica),2001,27(6):441-450.[2]YAMAMOTO Y,NAKAYAMA S,COHN C L,et al.Highly ef-ficient purificaiton of 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DOI:10.19462/ki.zgzy.20231103004蓖麻PIP5K1基因克隆、生物信息学及功能分析李明静1 袁朴芳1 罗 蕊1 尹明达1 王志妍1 户雪妹1 顾晓慧1 黄风兰1,2(1内蒙古民族大学生命科学与食品学院,通辽 028000;2内蒙古自治区蓖麻育种国家民委重点实验室/ 内蒙古自治区蓖麻育种与综合利用重点实验室/蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心/内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,通辽 028000)摘要:蓖麻PIP5K1基因在植物生长发育和抗逆过程中起重要作用。
为探究蓖麻PIP5K1基因在蓖麻物种中的生物学功能和不同时期雌性植株中的表达情况,以aLmAB2品系的蓖麻花序为试验材料,克隆PIP5K1基因,对该基因编码的蛋白质进行生物信息学分析,并对PIP5K1基因在不同时期雌性系植株的表达模式进行分析。
结果表明:从蓖麻花序轴顶端将总RNA 提取出来,并将其反转录成cDNA,克隆后得到一个全长为2325bp的PIP5K1基因片段,经测序后比对这一基因序列和NCBI 参考基因序列相同。
对该基因所编码蛋白展开生物信息学分析,确定PIP5K1基因所编码蛋白质的氨基酸等电点为8.85,氨基酸数目为774,分子量大小为87967.37Da,是一种亲水性稳定蛋白;无跨膜螺旋区,属于非跨膜蛋白;蛋白质二级结构由α螺旋、β转角、伸展链及无规卷曲构成;三级结构与二级结构预测结果一致;与同属于大戟科的木薯亲缘关系较近,与其他科亲缘关系较远。
qRT-PCR分析表明,PIP5K1在标雌系、单雌系、两性系花序中均有不同程度的上调和下调,推测PIP5K1基因参与蓖麻花序发育的调控。
本研究为探究PIP5K1基因促进蓖麻植株的生长发育机制奠定了理论基础。
关键词:蓖麻;PIP5K1;基因克隆;生物信息学分析;功能分析Cloning,Bioinformatics Analysis and Functional Analysis of Castor PIP5K1 Gene LI Mingjing1,YUAN Pufang1,LUO Rui1,YIN Mingda1,WANG Zhiyan1,HU Xuemei1,GU Xiaohui1,HUANG Fenglan1,2(1College of Life Sciences and Food Engineering,Inner Mongolia Minzu University,Tongliao 028000,Inner Mongolia;2Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding of the State Ethnic Affairs Commission/ Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding and Comprehensive Utilization/ InnerMongolia Engineering Research Center of Industrial Technology Innovation of Castor/ Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor,Tongliao 028000,Inner Mongolia)蓖麻(Ricinus Communis L.)是大戟科蓖麻属双子叶一年生或多年生草本植物,是一种用途广泛、经济效益高的非食用性作物,为世界十大油料作物之一,具有极高的附加价值[1]。
中国畜牧兽医 2022,49(7):2431-2441C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i ne 猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位齐南南,钱永航,罗 刚,司徒旭祺,刘吉英(江苏科技大学生物技术学院,镇江212018)摘 要:ʌ目的ɔ克隆猪的M i c r o r c h i d i a 家族C W 锌指蛋白2(M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W -t y p e z i n c f i n g e r 2,MO R C 2)基因,利用生物信息学手段分析其序列特征,并检测M O R C 2基因在猪不同组织中的表达情况和卵巢中的定位㊂ʌ方法ɔ以猪卵巢c D N A 为模板扩增和克隆M O R C 2基因完整C D S 区,并进行相似性比对及系统发育树构建;利用生物信息学软件对猪MO R C 2蛋白序列进行预测;使用实时荧光定量P C R 检测M O R C 2基因在猪不同组织中的表达情况;利用免疫组化方法检测猪MO R C 2蛋白在猪卵巢中的定位情况㊂ʌ结果ɔ猪M O R C 2基因C D S 区序列全长3102b p,编码1033个氨基酸㊂猪MO R C 2蛋白氨基酸序列与人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁小鼠㊁牛㊁绵羊㊁鸡和斑马鱼的相似性分别为94.8%㊁94.6%㊁94.9%㊁91.9%㊁93.8%㊁93.9%㊁80.8%和64.3%㊂系统进化树表明,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与斑马鱼(鱼类)亲缘关系最远㊂猪MO R C 2蛋白分子质量为117.44k u ,理论等电点为8.16,半衰期为30h ,属于不稳定蛋白㊂MO R C 2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白,不含跨膜结构和信号肽㊂猪MO R C 2蛋白有174个磷酸化位点㊁81个糖基化位点;亚细胞定位属于核蛋白,细胞质次之,线粒体中有少量表达;含有经典的MO R C 蛋白家族结构:G H K L -A T P a s e ㊁z f -C W 和C C 结构域㊂组织表达谱结果显示,M O R C 2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最多,显著高于其他组织(P <0.05),在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量较少,显著低于其他组织(P <0.05)㊂免疫组化结果显示,MO R C 2蛋白在健康猪卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达且表达量较高,在闭锁的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达量较少㊂ʌ结论ɔ试验成功获得猪M O R C 2基因完整C D S 区序列,该基因在猪各组织中广泛表达,MO R C 2蛋白主要在健康猪的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达㊂研究结果为进一步研究MO R C 2蛋白调控猪卵巢发育和卵泡闭锁的分子机制提供理论依据㊂关键词:猪;M O R C 2基因;克隆;表达;定位中图分类号:Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.001 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-17基金项目:江苏省自然科学基金(B K 20200994);国家自然科学青年基金(32102542)联系方式:齐南南,E -m a i l :1065810464@q q .c o m ㊂通信作者刘吉英,E -m a i l :l i u j i y i n g @ju s t .e d u .c n C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s a n dT i s s u eE x pr e s s i o n L o c a t i o no f P o r c i n e M O R C 2G e n eQ IN a n n a n ,Q I A N Y o n g h a n g ,L U O G a n g ,S I T U X u q i ,L I UJ i y i n g(S c h o o l o f B i o t e c h n o l o g y ,J i a n g s uU n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,Z h e n j i a n g 212018,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h ea i m o f t h i ss t u d y w a s t oc l o n e p o r c i n e M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W -t y pe z i n cf i ng e r 2(MO R C 2)g e n e ,a n a l y z e th e s e q u e n c e c h a r a c t e ri s t i c s u s i n g b i o i n f o r m a t i c s ,a n dd e t e c t t h e e x p r e s s i o no f M O R C 2g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s a n d t h e l o c a l i z a t i o n o f M O R C 2g e n e i n o v a r y o f p i g s .ʌM e t h o d ɔT h e c o m p l e t eC D S r e g i o no f M O R C 2g e n ew a s a m p l i f i e d a n dc l o n e dw i t h p o r c i n e o v a r y c D N Aa s t e m p l a t e ,a n dt h es i m i l a r i t y c o m p a r i s o na n d p h y l o ge n e t i c t r e ec o n s t r u c t i o nw e r e c a r r i e do u t .T h e s e q u e n c eof p o r c i n e MO R C 2p r o t e i nw e r e p r e d i c t e db y bi o i n f o r m a t i c s s o f t w a r e .中国畜牧兽医49卷T h ee x p r e s s i o n o f M O R C2g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f p i g s w e r e d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.T h e l o c a t i o n o f MO R C2p r o t e i n i n p o r c i n e o v a r y w a s d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d.ʌR e s u l tɔT h e l e n g t ho f M O R C2g e n eC D Sw a s3102b p,e n c o d i n g 1033a m i n oa c i d s.T h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f p o r c i n e MO R C2p r o t e i n h a d94.8%,94.6%, 94.9%,91.9%,93.8%,93.9%,80.8%a n d64.3%s i m i l a r i t y w i t h H u m a ns a p i e n s,P a n t r o g l o d y t e s,M a c a c am u l a t t a,M u sm u s c u l u s,B o s t a u r u s,O v i sa r i e s,G a l l u s g a l l u s a n d D a n i o r e r i o,r e s p e c t i v e l y.P h y l o g e n e t i ct r e e sr e v e a l e dt h a t p i g w a s m o s tc l o s e l y r e l a t e dt o p r i m a t e s, r u m i n a n t s a n d r o d e n t s w e r en e x t,a n d t h e f a r t h e s t r e l a t e dw a s D a n i o r e r i o.T h em o l e c u l a rw e i g h t o f p o r c i n eMO R C2p r o t e i nw a s117.44k u,t h e i s o e l e c t r i c p o i n tw a s8.16,t h eh a l f-l i f ew a s30h, a n d t h e r ew e r en ot r a n s m e m b r a n es t r u c t u r ea n ds i g n a l p e p t i d e s,i tw a sa nu n s t a b l eh y d r o p h i l i c p r o t e i n.T h e r ew e r e174p h o s p h o r y l a t i o nm o d i f i c a t i o n s i t e s a n d81g l y c o s y l a t i o nm o d i f i c a t i o n s i t e s o fMO R C2p r o t e i n,i tw a s m a i n l y l o c a t e di nc e l ln u c l e a r,l e s si nc y t o p l a s m a n d m i t o c h o n d r i a. MO R C2p r o t e i nc o n t a i n e dt h ec l a s s i c a lMO R C p r o t e i nf a m i l y s t r u c t u r e(G H K L-A T P a s e,z f-C W a n d C C d o m a i n).T i s s u e e x p r e s s i o n p r o f i l e r e s u l t s s h o w e d t h a t M O R C2g e n e w a s w i d e l y e x p r e s s e d i n11t i s s u e so f p i g s,t h ee x p r e s s i o n w a st h eh i g h e s t i nl i v e r,w h i c h w a ss i g n i f i c a n t h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s(P<0.05),a n d t h e e x p r e s s i o nw e r e t h e l o w e s t i nh e a r t,l u n g a n d m u s c l e,w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l o w e r t h a n t h a t i no t h e r t i s s u e s(P<0.05).I m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s s h o w e d t h a tMO R C2p r o t e i nw a s e x p r e s s e d i nb o t h g r a n u l o s a c e l l s a n dm e m b r a n e c e l l s o f h e a l t h yp i g s,a n dt h ee x p r e s s i o n w a sh i g h e r,b u t l e s si na t r e t i c g r a n u l o s ac e l l sa n d m e m b r a n e c e l l s.ʌC o n c l u s i o nɔT h eC D So f p o r c i n e M O R C2g e n ew a so b t a i n e d,i tw a sw i d e l y e x p r e s s e d i n v a r i o u s t i s s u e s.MO R C2p r o t e i n w a se x p r e s s e di nb o t h g r a n u l o s ac e l l sa n d m e m b r a n ec e l l so f h e a l t h yp i g s.T h er e s u l t s p r o v i d e d at h e o r e t i c a lb a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c h o nt h e m o l e c u l a r m e c h a n i s mo fMO R C2p r o t e i n r e g u l a t i n gp o r c i n e o v a r i a nd e v e l o p m e n t a n d f o l l i c u l a r a t r e s i a.K e y w o r d s:p i g s;M O R C2g e n e;c l o n i n g;e x p r e s s i o n;l o c a t i o nM i c r o r c h i d i a家族C W锌指蛋白(M i c r o r c h i d i a f a m i l y C W-t y p e z i n c f i n g e r,MO R C)与减数分裂和精子发生相关,被称为小睾丸基因[1]㊂MO R C2是MO R C家族蛋白的一员,由多个保守的结构域组成㊂MO R C2蛋白包含G H K L-A T P酶结构域(G H K L-A T P a s e)㊁C W结构域和3个无规则卷曲(c o i l e d c o i l,C C)结构域[2-3]㊂MO R C2蛋白N-端的促旋酶㊁组氨酸激酶和G H K L结构域共同构成一个具有催化活性的A T P酶模块,该模块在调控染色质结构和基因表达方面起着关键作用[2]㊂MO R C2蛋白的G H K L结构域包含1个铰链的关键功能卷曲(C C1),而其他G H K L-A T P酶则不存在该结构域,推测该结构域在MO R C2蛋白功能调控中起重要作用㊂锌指C W结构域由4个半胱氨酸(C y s,C)残基与锌配价相连接,并含有2~4个保守的色氨酸(T r p,W)残基㊂锌指C W结构域是常见的与D N A 结合的转录因子的结构之一[4-5],可见MO R C2蛋白可作为转录调控因子调控基因的表达㊂植物和脊椎动物中大多数MO R C2蛋白C-端都含有1个C C结构域[3],这种结构存在于真核细胞染色质中,可以识别组蛋白和非组蛋白中的甲基化肽㊂因此, MO R C2蛋白是一个进化上保守的蛋白,其在动植物中具有类似的功能㊂MO R C2蛋白控制着多种细胞生理功能,是轴突腓骨肌萎缩症(C MT)和多种癌症的致病基因[6-10]㊂除此之外,MO R C2作为新的表观遗传调控因子在基因沉默㊁染色质重塑㊁D N A损伤修复等过程中起着至关重要的作用[3,11-12],但对其功能的研究主要集中在医学领域,尚处于探索阶段㊂研究发现,MO R C2被p21活化酶1(P A K1)磷酸化可促进D N A损伤修复[13]㊂D N A损伤后,P A R P1招募MO R C2到D N A损伤位点,催化MO R C2的P A R y l a t i o n,从而激活其A T P酶和染色质重构活性[11]㊂另外,MO R C2可作为表观遗传调控因子参与基因的表达调控,通过与人类沉默中枢(HU S H)复合物关联进而调节异染色质的形成和表观遗传基因的沉默[14]㊂目前MO R C2蛋白在正常细胞中的功能研究较少㊂有报道发现,在小鼠骨骼肌细胞23427期齐南南等:猪M O R C2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位(C2C12)中MO R C2通过抑制细胞分化促进细胞增殖[15];在脂肪细胞中M D M2可通过调节L I P I N1与MO R C2互作调节脂肪细胞功能[16];在小鼠的卵巢和睾丸中M O R C2基因的表达量较高,该基因的同源基因M O R C2b失活后抑制P R D M9对生殖细胞的调控,造成多种与减数分裂相关的基因错误表达,敲除M O R C2b基因的雌性小鼠卵巢发育受阻不能形成成熟的卵泡,最终丧失生殖功能[12]㊂由此推测,MO R C2可能参与了哺乳动物卵巢发育与繁殖的调控,但具体机制尚不清楚㊂卵巢发育与繁殖性能息息相关,目前国内外鲜有关于大型家畜(如猪)M O R C2基因结构与功能的报道㊂鉴于此,本研究克隆猪M O R C2基因序列并进行生物信息学分析,检测该基因在猪不同组织中的表达以及在卵巢组织中的定位情况,以期为进一步研究M O R C2基因的生物学功能和选育高繁殖力猪种提供参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1样品采集3头大长白三元杂交商品猪由南京竹顺生物技术有限公司提供,屠宰后采集心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁胃㊁肌肉㊁大肠㊁小肠㊁卵巢和子宫共11种组织,放入冻存管,立即投入液氮中贮存备用㊂取卵巢组织置于4%多聚甲醛中固定用于免疫组化检测㊂1.1.2主要试剂 K O D O n e T M P C R M a s t e r M i x (K MM-201,T O B O Y O)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;T r i z o l㊁P r i m e S c r i p t T M R TR e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r反转录试剂盒㊁p M D19-T V e c t o r C l o n i n g K i t均购自T a K a R a公司;大肠杆菌D H5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;实时荧光定量试剂(N o v o S t a r t S Y B R q P C R S u p e r M i xP l u s,E096-01A)购自上海近岸科技有限公司;MO R C2蛋白一抗(D123592)购自生工生物工程(上海)股份有限公司㊂1.2方法1.2.1 总R N A提取及c D N A合成采用T r i z o l进行组织R N A提取;采用P r i m e S c r i p t T M R T R e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r反转录试剂盒进行反转录㊂去除基因组D N A反应:总R N A1μg,5ˑg D N A E r a s e rB u f f e r2μL,g D N A E r a s e r1μL,加去离子水至10μL㊂反应条件:42ħ2m i n㊂反转录反应:上面步骤的反应液10μL,P r i m e S c r i p tR T E n z y m eM i xⅠ1μL,R T P r i m e r M i x1μL,5ˑP r i m e S c r i p tB u f f e r24μL,R N a s e-f r e e d H2O4μL㊂反应条件:37ħ15m i n;85ħ5s㊂c D N A于―20ħ保存备用㊂1.2.2 引物设计及合成根据G e n B a n k中猪M O R C2基因预测序列(登录号:X M_005670853.3),利用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计克隆及定量引物,同时设计G A P DH内参基因(登录号:NM_ 001206359.1)定量引物,引物序列见表1㊂引物均由杭州尚亚生物技术公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħ片段大小P r o d u c tl e n g t h/b p用途P o u r p o s eM O R C2F:A T G G C T T T C A C A A A T T A C A G C A G T C T G A A T C R:T T A G T C C C C C T T G G T G A T C A G G T C C 683102克隆M O R C2F:T C A C C A A G A A G G A A G A C A C T AR:A G A T G A T G A C C A G C G T T C C 60252实时荧光定量P C RG A P DH F:G G A C T C A T G A C C A C G G T C C A TR:T C A G A T C C A C A A C C G A C A C G T60220实时荧光定量P C R1.2.3 P C R扩增及克隆 P C R扩增体系25μL:高保真酶1μL,上㊁下游引物各1.5μL,c D N A模板1μL,双蒸水20μL㊂P C R反应条件:98ħ预变性10s;98ħ变性10s,68ħ退火延伸20s,共40个循环;72ħ延伸7m i n㊂P C R产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,将目的片段纯化回收后连接到p M D19-T载体上,转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,利用氨苄青霉素L B固体培养基筛选阳性单克隆,经P C R验证后送至杭州尚亚生物技术公司进行测序㊂3342中国畜牧兽医49卷1.2.4生物信息学分析利用D N AMA N软件将扩增获得的猪C D S序列与N C B I上公布的8个物种的M O R C2基因C D S序列进行相似性比对;利用M e g a7.0程序构建系统进化树;使用E x P A S y-P r o t P a r a m在线软件(h t t p s:ʊw w w.e x p a s y.o r g/ p r o t p a r a m/)分析MO R C2蛋白理化性质及亲/疏水性;使用T MHMM2.0在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p? T MHMM-2.0)进行跨膜区预测;使用S i g n a I P5.0在线软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/ s e r v i c e.p h p S i g n a l P-5.0)进行信号肽预测;利用N e t O G l y c4.0(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e.p h p?N e t O G l y c-4.0)和N e t N G l y c1.0 (h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p? N e t N G l y c-1.0)在线软件进行糖基化位点预测;使用N e t P h o s3.1(h t t p:ʊw w w.c b s.d u t.d k/ s e r v i c e s/N e t P h o s/)进行磷酸化位点预测;使用U n i P r o t K B/S w i s s-P r o t在线软件(h t t p s:ʊw w w. u n i p r o t.o r g/)进行亚细胞定位预测;使用S MA R T 在线软件(h t t p:ʊs m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e/)进行结构域预测;使用P R A B I在线软件(h t t p s:ʊp r a b i.i b c p.f r/h t m/s i t e/w e b/h o m e)进行二级结构预测;使用S W I S S-MO D E L在线软件(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)进行三级结构预测;使用S T R I N G10.5在线软件(h t t p s:ʊs t r i n g-d b.o r g/)预测与MO R C2互作的蛋白㊂1.2.5实时荧光定量P C R进行组织表达谱分析 P C R扩增体系20μL:2ˑN o v o S t a r t S Y B R q P C R S u p e r M i x P l u s10μL,上㊁下游引物各0.5μL,模板1μL,R N a s e-f r e ed d H2O补足体系㊂P C R扩增条件:95ħ预变性1m i n;95ħ变性20s, 60ħ退火20s,72ħ延伸30s,共35个循环㊂采用2―ΔΔC t法计算其相对表达量㊂利用S P S S19.0软件对数据进行单因素方差分析(O n e-W a y A N O V A),数据用平均值ʃ标准差表示,以P<0.05为差异显著性判断标准㊂1.2.6免疫组化将固定好的猪卵巢组织用石蜡进行包埋,切片机切成5μm厚度的薄片置于载玻片上,37ħ烘干;利用二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精进行脱蜡处理;滴加3%H2O2浸泡10m i n去除内源性过氧化物氢酶;120ħ5m i n进行抗原修复, P B S洗2遍,加入1%B S A,37ħ孵育30m i n;加入一抗100μL(1ʒ100),4ħ过夜孵育;P B S洗3次,加入二抗,37ħ孵育30m i n;P B S洗3次,D A B室温孵育10m i n,自来水终止显色;将组织切片置于苏木素中染色30s,自来水冲洗后用70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯进行脱水处理;用中性树胶进行封片㊂2结果2.1猪M O R C2基因克隆测序以猪卵巢c D N A为模板进行P C R扩增,P C R 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,片段大小约为3102b p(图1),与预期相符㊂将该片段纯化回收后连接到p M D19-T载体上,挑取阳性克隆经P C R验证后送测序,所获序列与猪M O R C2基因预测序列(G e n B a n k登录号:X M_005670853.3)相似性达99.97%,在1796b p处由G突变为C,但没引起氨基酸的改变,说明成功扩增出猪M O R C2基因C D S区序列㊂图1猪M O R C2基因C D S区P C R扩增结果F i g.1P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t o f p o r c i n e M O R C2g e n eC D S2.2相似性比对及系统进化树构建利用M e g A l i g n软件将猪MO R C2蛋白的氨基酸序列与人(登录号:N P_001290185.1)㊁黑猩猩(登录号:J A A34109.1)㊁恒河猴(登录号:X P_ 015005504.1)㊁小鼠(登录号:N P_001152760.1)㊁牛(登录号:X P_027422090.1)㊁绵羊(登录号:X P_ 042090778.1)㊁鸡(登录号:X P_040540971.1)和斑马鱼(登录号:N P_001003994.1)进行比对,相似性分别为94.8%㊁94.6%㊁94.9%㊁91.9%㊁93.8%㊁93.9%㊁80.8%和64.3%(图2),表明MO R C2蛋白在不同物种间高度保守㊂以斑马鱼为外种群构建MO R C2蛋白系统进化树,结果显示,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与鸡和斑马鱼亲缘关系最远(图3)㊂43427期齐南南等:猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位图2 不同物种M O R C 2基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o fM O R C 2p r o t e i n i nd i f f e r e n t s pe c i es 图3 M O R C 2蛋白系统进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e o fM O R C 2p r o t e i n 2.3 生物信息学分析2.3.1 理化性质 猪M O R C 2基因编码1033个氨基酸,分子质量为117.44k u ,理论等电点为8.16,含有常见的20种氨基酸,其中谷氨酸(G l u )含量最多(10.1%),色氨酸(T r p )含量最少(0.9%),不含吡咯赖氨酸(P y l )和硒半胱氨酸(S e c );总负电荷氨基酸残基(A s p +G l u )为160个,总正电荷氨基酸残基(A r g +L ys )为164个(表2)㊂猪M O R C 2蛋白的失稳指数为57.46,为不稳定蛋白质,估计半衰期为30h㊂猪M O R C 2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白㊂表2 猪M O R C 2蛋白氨基酸组成T a b l e 2 A m i n o a c i d c o m p o s i t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 氨基酸A m i n o a c i d s 数量N u m b e r/个占比P e r c e n t a ge /%氨基酸A m i n o a c i d s数量N u m b e r/个占比P e r c e n t a ge /%A l a (A )797.6I l e (I )464.5A r g (R )848.1L e u (L )838.0A s n (N )302.9L y s (K )807.7A s p (D )565.4M e t (M )212.0C y s (C )131.3P h e (F )313.0G l n (Q )474.5P r o (P )767.4G l u (E )10410.1S e r (S )706.8G l y (G )444.3T h r (T )595.7H i s (H )131.3T r p (W )90.9T yr (Y )272.6V a l (V )615.95342中 国 畜 牧 兽 医49卷2.3.2 跨膜结构㊁信号肽及翻译后修饰 利用T MHMM2.0在线软件对猪MO R C 2蛋白进行跨膜区预测发现,该蛋白不含跨膜结构(图4)㊂利用S i gn a I P5.0在线软件对猪MO R C 2蛋白进行信号肽预测发现,该蛋白不含信号肽(图5)㊂表明猪MO R C 2蛋白既不属于跨膜蛋白也不属于分泌型蛋白㊂利用N e t N G l y c1.0㊁N e t O G l yc4.0在线软件对猪MO R C 2蛋白的糖基化位点进行预测发现,该蛋白存在3个N -糖基化位点,78个O -糖基化位点㊂通过N e t P h o s 3.1在线软件分析猪MO R C 2蛋白发现,该蛋白存在174个磷酸化位点㊂图4 猪M O R C 2蛋白跨膜区预测F i g.4 T r a n s m e m b r a n e d o m a i n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图5 猪M O R C 2蛋白信号肽预测F i g .5 S i g n a l p e pt i d e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 2.3.3 亚细胞定位 利用U n i P r o t K B /S w i s s -P r o t 在线软件进行蛋白亚细胞定位显示,猪MO R C 2蛋白主要定位于细胞核,其次是细胞质,线粒体中含有少量的MO R C 2蛋白,在其他的细胞器如高尔基体和溶酶体等中不表达(图6)㊂2.3.4 结构域 利用S MA R T 在线软件对猪MO R C 2蛋白进行结构域预测,结果显示,猪MO R C 2蛋白含1个G H K L -A T P a s e 结构域㊁1个经典的P f a m :z f -C W 结构域及3个C C 结构域(图7)㊂2.3.5 二级结构和三级结构 利用P R A B I 在线软件对猪MO R C 2蛋白二级结构进行预测发现,M O R C 2蛋白主要由α-螺旋㊁延伸链和无规则卷曲组成,占比分别为35.24%㊁8.62%和56.15%(图8)㊂利用S W I S S -M O D E L 在线软件对猪M O R C 2蛋白进行三级结构预测发现,与二级结构结果一致(图9)㊂2.3.6 互作蛋白 利用S T R I N G 在线软件蛋白质相互作用数据库预测发现,猪MO R C 2蛋白的互作蛋白较少,主要有MO R C 1㊁P A K 1㊁WD R 76㊁WD R 75㊁T R I M 28和S C H B P 1(图10)㊂63427期齐南南等:猪M O R C 2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位图6 猪M O R C 2蛋白亚细胞定位预测F i g.6 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图7 猪M O R C 2蛋白功能结构域预测F i g.7 F u n c t i o n a l d o m a i n p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in h ,α-螺旋;e ,延伸链;c ,无规则卷曲;t ,β-转角h ,A l p h ah e l i x ;e ,E x t e n d e d c h a i n ;c ,R a n d o mc o i l ;t ,B e t a t u r n 图8 猪M O R C 2蛋白二级结构预测F i g .8 S e c o n d a r ys t r u c t u r e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e in 图9 猪M O R C 2蛋白三级结构预测F i g .9 T e r t i a r y st r u c t u r e p r e d i c t i o no f p o r c i n eM O R C 2p r o t e i n 7342中国畜牧兽医49卷图10猪M O R C2蛋白互作蛋白网络预测F i g.10P r o t e i n i n t e r a c t i o n n e t w o r k p r e d i c t i o n o f p o r c i n e M O R C2p r o t e i n2.4M O R C2基因在猪各组织中的表达利用实时荧光定量P C R检测M O R C2基因在猪不同组织中的表达情况,结果见图11㊂由图11可知,M O R C2基因在猪肝脏中的表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),在脾脏㊁胃㊁肾脏㊁大肠㊁小肠㊁子宫和卵巢中的表达量较高,在心脏㊁肺脏和肌肉中的表达量较低,显著低于其他组织(P< 0.05)㊂2.5M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位利用免疫组化技术检测M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位情况,结果见图12㊂由图12可知,M O R C2肩标不同字母表示差异显著(P<0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)V a l u e s w i t h d i f f e r e n tl e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t s m e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05)图11M O R C2基因在猪不同组织中的相对表达量F i g.11R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f M O R C2g e n ei n p o r c i n e d i f f e r e n t t i s s u e s蛋白在猪的健康初级卵泡㊁次级卵泡㊁成熟卵泡的颗粒细胞和膜细胞中表达量较高;在闭锁卵泡的颗粒细胞和膜细胞中表达量较低㊂表明猪MO R C2蛋白可能参与了猪卵泡闭锁调控㊂①A,初级卵泡(100ˑ);B,次级卵泡(40ˑ);C㊁D,成熟卵泡(40ˑ);E,初级闭锁卵泡及次级闭锁卵泡(100ˑ);F,闭锁卵泡(40ˑ)㊂②ң,不同级别的卵泡;T C,卵泡膜细胞;G C,卵泡颗粒细胞①A,P r i m a r y f o l l i c l e(100ˑ);B,S e c o n d a r y f o l l i c l e(40ˑ);Ca n dD,M a t u r e f o l l i c l e(40ˑ);E,P r i m a r y a n ds e c o n d a r y a t r e s i af o l l i c l e(100ˑ);F,A t r e s i a f o l l i c l e(40ˑ).②ң,D i f f e r e n t l e v e l s o f f o l l i c l e s;T C,F o l l i c l e t h e c a c e l l;G C,F o l l i c l eg r a n u l o s a c e l l s 图12M O R C2蛋白在猪卵巢中的定位F i g.12L o c a l i z a t i o no fM O R C2p r o t e i n i n p o r c i n e o v a r i a n83427期齐南南等:猪M O R C2基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达定位3讨论本研究获得猪M O R C2基因C D S区序列全长3102b p,编码1033个氨基酸㊂通过对不同物种的M O R C2基因编码氨基酸序列进行相似性比对发现,MO R C2在哺乳动物中高度保守,表明猪MO R C2蛋白可能与其他物种的MO R C2蛋白功能相似,在染色质重塑㊁表观遗传修饰㊁基因转录调控等过程中具有重要的作用㊂对于MO R C2蛋白的亚细胞定位,MO R C2蛋白存在核定位信号,有利于MO R C2进入细胞核进而起到调控基因转录调控的作用,目前关于该蛋白功能的研究也主要集中在细胞核中[11,17]㊂但研究发现MO R C2的定位可以从细胞核到细胞质发生改变,如C2C12细胞诱导分化后MO R C2从细胞核转到细胞质[15]㊂S a n c h e z-S o l a n a等[18]研究发现,MO R C2在脂肪细胞细胞质中的含量升高可促进A T P-柠檬酸裂解酶的活化㊂可见MO R C2蛋白不仅仅在细胞核内发挥作用,还与细胞质中的多种生物学功能相关㊂蛋白结构域预测结果显示,猪与人MO R C2蛋白相似,均具有1个G H K L-A T P a s e结构域㊁1个经典的z f-C W结构域及3个C C结构域[2]㊂动植物中,MO R C家族的G H K L-A T P a s e结构域是转座元件(T E)沉默和异染色质凝聚所必需的,推测猪MO R C2可能参与染色质重塑过程的调控㊂在动物MO R C蛋白家族中,C W结构域位于C-端C C 结构域的上游[9]㊂C W结构域可以与染色体重构蛋白结合,选择性识别甲基化H3K4,MO R C3/4是组蛋白H3K4m e3的结合物,而MO R C1和MO R C2的C W区域均缺乏组蛋白H3K4的结合能力,但HU S H和MO R C2可以选择性结合转录因子,促进组蛋白H3在L y s9位点的三甲基化(H3K9m e3)进而沉默转录[2],表明MO R C2不通过组蛋白H3K4途径进行表观遗传调控,而MO R C2通过C W区域进行表观调控的分子机制有待进一步研究㊂除此之外,A T P酶和C W结构域协同作用于MO R C4与核小体核心粒子(N C P)的结合部位,增强D N A包裹组蛋白核心的能力,阻碍D N A相关蛋白(如转录因子)与N C P的结合[19]㊂由此可见,C W结构域对于MO R C2蛋白是非常必要的㊂C C结构域在MO R C2调控D N A 修复过程中起到重要作用,C C结构域已被证明在调节蛋白质-蛋白质和蛋白质-D N A相互作用,以及影响蛋白质稳定性和亚细胞定位方面发挥重要作用[3,20]㊂MO R C2通过其C C结构域形成同质二聚体,加强了染色质动力学进而促进D N A修复,敲除MO R C2蛋白C-末端C C结构域后可降低组蛋白H2A X磷酸化,阻止D N A修复蛋白B R C A1㊁53B P1和R a d51的募集,从而降低细胞存活率[3],但是C C结构域的功能还有待进一步研究㊂预测MO R C2的互作蛋白为MO R C1㊁P A K1㊁WD R76㊁WD R75㊁T R I M28和S C H B P1,其中MO R C1主要在雄性生殖细胞中表达,M O R C1基因敲除的小鼠雄性生殖细胞丢失且不育[12],该基因在雌性生殖系统中的研究鲜见报道㊂在鸡卵巢等级卵泡发育过程中,P A K1通过调控R A F-M E K-E R K 介导S L I T2对G C增殖的抑制作用[21],另外,P A K1可以磷酸化MO R C2[13],促进D N A损伤修复,但MO R C2是否与P K A1互作调控猪卵泡发育或闭锁有待进一步研究㊂目前,尚没有关于WD R75㊁S C H B P1和WD R76在卵巢发育或闭锁中功能的研究㊂由于MO R C2功能研究才刚起步,因此当前预测的MO R C2互作蛋白较少,随着对其功能研究的深入,可能会发现更多的MO R C2互作蛋白㊂D i n g 等[9]对M O R C2基因在人各组织中的表达分析发现,M O R C2基因在多个组织中均有表达㊂本研究中,M O R C2基因在猪不同组织中广泛表达,其中在肝脏中的表达量最高,在子宫㊁卵巢㊁大肠㊁胃㊁肾脏和脾脏中表达量较高,在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量较低㊂卵泡闭锁在哺乳动物卵巢中十分常见,卵泡闭锁可以出现在不同发育时期[22-23],最终造成卵子大量丢失,大大降低了雌性畜禽的生产性能㊂引起卵泡闭锁的机制非常复杂,研究认为,颗粒细胞凋亡是引起卵泡闭锁的标志性事件[24-26],截止目前,关于颗粒细胞凋亡的研究主要集中在自噬㊁氧化应激㊁m i R N A和l n c R N A等方面[27-32]㊂MO R C2是重要的凋亡调控因子,研究显示,小鼠M O R C2b基因敲除后引起卵泡发育障碍,造成雌鼠繁殖性能降低[12],推测MO R C2蛋白可能在卵巢发育或卵巢闭锁中起到重要的调控作用㊂本研究结果显示, MO R C2蛋白在猪各级健康卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达,在闭锁卵泡中的表达量较低,表明MO R C2蛋白可能参与了猪卵泡闭锁的调控,但具体的调控机理仍不明确,今后将进一步研究M O R C2基因在大型家畜(猪)卵巢发育及卵泡颗粒细胞凋亡中的作用㊂9342中国畜牧兽医49卷4结论试验成功获得猪M O R C2基因C D S区序列,猪MO R C2蛋白是一个进化上保守的蛋白,主要定位于细胞核,细胞质次之,线粒体中仅有少量表达,可能与MO R C1㊁P A K1㊁WD R76㊁WD R75㊁T R I M28和S C H B P1具有相互作用㊂M O R C2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最高,在心脏㊁肺脏和肌肉中表达量最少㊂MO R C2蛋白在猪卵巢各级卵泡的膜细胞和颗粒细胞中均有表达,且在健康卵泡中的表达量高于闭锁卵泡㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]I N O U E N,H E S S K D,MO R E A D I T 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铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析简介铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是一种重要的中药材,其具有很高的药用价值。
RCA2基因是铁皮石斛中的一个重要基因,该基因在植物的抗逆性和发育过程中起着重要的作用。
因此,对该基因进行研究有助于深入了解铁皮石斛的药用价值和生长发育过程,同时也对植物基因组学研究有一定的参考意义。
本文将介绍铁皮石斛RCA2基因的克隆过程以及生物信息学分析。
实验方法RNA抽提和cDNA合成从铁皮石斛中选取健康的石斛苗,将其上部分的新鲜叶片取出并立即放入液氮中冷冻,随后将其保存在-80℃的冰箱中。
使用TRIzol Reagent将叶片细胞中的总RNA抽提出来,并通过纳米分光光度计检测RNA的完整性和纯度。
接下来使用PrimeScript RT reagent Kit将RNA逆转录为cDNA。
选取RCA2序列并进行PCR扩增通过NCBI数据库获取铁皮石斛的RCA2基因序列,在序列设计时优选剪切点、引物长度、引物富含GC等一系列条件。
使用DNA polymerase将RCA2序列进行PCR扩增,并使用Agarose Gel检测PCR扩增产物的大小和纯度。
克隆和序列测定将PCR扩增得到的RCA2基因片段进行克隆,并发送至测序公司进行序列测定。
随后使用Gene Runner分析序列,标记基因的起始和终止位置,并检测其氨基酸序列的变异情况。
生物信息学分析氨基酸序列预测使用Expasy ProtParam在线工具对克隆得到的铁皮石斛RCA2基因编码的蛋白质进行预测。
结果显示,该蛋白质分子量为30.2kDa,等电点为9.18。
同时预测获得其亲水性、疏水性、螺旋等二级结构和残基上的保守性等信息。
保守区域比对分析将铁皮石斛得到的RCA2基因序列和其他物种中已知的RCA2基因序列进行比对分析。
比对结果显示,在所有样品中,RCA2的C端区域存在较高的保守区域,并且该区域在铁皮石斛中具有极高的相似性。
《马属雄性动物DDX3Y基因片段克隆测序及生物信息学分析》篇一一、引言近年来,随着生物技术的快速发展,基因克隆测序和生物信息学分析已成为研究动物遗传学和生物学特性的重要手段。
DDX3Y基因作为马属雄性动物特有的基因片段,其研究对于揭示动物性别决定机制、遗传特征及进化关系具有重要意义。
本文以马属雄性动物为研究对象,对其DDX3Y基因片段进行克隆测序及生物信息学分析,以期为相关研究提供基础数据和理论支持。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的马属雄性动物样本均来自正规养殖场,经过严格筛选和鉴定,确保样本的纯度和质量。
实验所需试剂和仪器均符合相关标准。
2. 方法(1)基因克隆:提取马属雄性动物基因组DNA,设计特异性引物,通过PCR技术扩增DDX3Y基因片段,将扩增产物进行克隆,获得重组质粒。
(2)测序:将重组质粒送至测序公司进行测序,获得DDX3Y基因片段的序列信息。
(3)生物信息学分析:利用生物信息学软件和数据库,对测序结果进行比对、注释和分析,包括基因序列比对、功能预测、进化分析等。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR技术成功扩增出马属雄性动物DDX3Y基因片段,克隆后获得重组质粒,经鉴定质量良好,可用于后续测序实验。
2. 测序结果将重组质粒送至测序公司进行测序,获得了高质量的DDX3Y基因片段序列信息。
通过序列比对,发现该序列与已报道的马属动物DDX3Y基因序列高度相似,表明实验结果可靠。
3. 生物信息学分析结果(1)基因序列比对:将测序得到的DDX3Y基因片段序列与已报道的序列进行比对,发现二者具有高度的相似性,表明该基因在马属动物中具有较高的保守性。
(2)功能预测:通过生物信息学软件对DDX3Y基因进行功能预测,发现该基因可能参与细胞增殖、分化及性别决定等生物学过程。
(3)进化分析:基于DDX3Y基因序列,对不同种属的马属动物进行进化分析,发现它们之间存在一定的亲缘关系,为进一步研究马属动物的进化关系提供了基础数据。
《三个甜瓜ERF基因的克隆及初步功能分析》篇一一、引言近年来,随着分子生物学技术的快速发展,基因克隆与功能分析成为了植物遗传学和作物育种领域的重要研究内容。
甜瓜作为一种重要的经济作物,其抗病性、抗逆性等性状的遗传改良具有重要意义。
本文以三个甜瓜ERF基因的克隆为研究对象,对这三个基因的初步功能进行了分析,以期为甜瓜的遗传育种提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料本实验选取了三个甜瓜品种作为研究对象,包括两个抗病品种和一个敏感品种。
从这些品种中提取了基因组DNA和mRNA。
2. 方法(1)基因克隆:利用PCR技术,以甜瓜基因组DNA为模板,扩增出三个ERF基因的编码区。
(2)生物信息学分析:对克隆得到的基因进行序列分析,预测其编码的蛋白质理化性质、结构及功能域等。
(3)初步功能分析:通过构建过表达和沉默载体,将这三个ERF基因在模式植物中进行过表达和沉默实验,观察其对植物抗病性、抗逆性等性状的影响。
三、结果与分析1. 基因克隆结果通过PCR扩增,成功克隆了三个甜瓜ERF基因的编码区。
测序结果表明,这三个基因的序列与已知的ERF基因具有较高的相似性。
2. 生物信息学分析结果(1)理化性质分析:通过生物信息学软件预测,这三个ERF基因编码的蛋白质具有典型的ERF结构域,属于ERF家族成员。
它们的分子量、等电点等理化性质具有一定的差异。
(2)结构与功能域分析:进一步分析发现,这三个ERF基因编码的蛋白质具有相似的三级结构,均包含ERF功能域和其他保守结构域。
这些结构域可能与它们的生物学功能密切相关。
3. 初步功能分析结果(1)过表达实验:将三个ERF基因分别构建到过表达载体中,并转化到模式植物中。
观察发现,过表达这些基因的植物在抗病性、抗逆性等方面表现出了一定的优势。
其中,某些性状得到了显著改善。
(2)沉默实验:为了进一步验证这些ERF基因的功能,我们构建了沉默载体,将它们在模式植物中进行沉默。
结果显示,沉默这些基因的植物在抗病性、抗逆性等方面表现出了一定的劣势。
功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要:随着多种生物全基因组序列的获得,基因组研究正从结构基因组学(structural genomics)转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。
功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等),其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1],它代表了基因分析的新阶段,已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。
功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究,是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。
如何研究功能基因,也成为我们面临的一个课题,本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。
关键词:功能基因、克隆、生物信息学分析。
1.功能基因的克隆1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆,它是根据目标基因在染色体上确切位置,寻找与其紧密连锁的分子标记,筛选BCA克隆,通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域,根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因,得到候选基因后再确定目标基因。
优点是无需掌握基因产物的任何信息,从突变体开始,逐步找到基因,最后证实该基因就是造成突变的原因。
通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆,最近也有报道某些控制数量性状的主效基因(控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等)也通过图位克隆法获得。
1.2 同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物,在已知材料中扩增到该片段,并经克隆测序验证,利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针,与待研究材料的cDNA文库杂交,就可以获得该基因cDNA克隆,利用克隆进一步筛选基因组文库,挑选阳性克隆,亚克隆并测序,从中就可以筛选到该基因的完整序列。
1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。
(Linkage disequilibrium, LD)。
与连锁分析不同, 连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。
历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上, 这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉, 从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotype block)。
这样经过很多世代的重组, 只有相隔很近的基因, 才能仍处在相同的原始单倍型片段上, 基因间的连锁不平衡才能依然存在。
所以基于连锁不平衡分析, 可以实现目的基因的精细定位。
林木大多为自由授粉的异交物种, 所以连锁不平衡程度很低, 林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域, 这就为目的基因的精细定位提供了可能, 结合SNP 检测技术, 科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来, 进行数量性状寡核苷酸(Quantitative trait nucleotide, QTN)作图。
当然除了相隔很近的基因, 某些相隔较远的基因, 由于受相同的选择压力, 也可能产生连锁不平衡。
但通过家系分析, 首先可以进行目的基因的粗略定位, 将目的基因首先限定到一个较小的区域, 只针对该区域内的SNP 进行相关性分析, 从而消除非由连锁引起的连锁不平衡干扰。
随着林木全基因组测序的发展, 连锁图谱与LD 分析相结合的方法将是在林木中实现未知基因克隆的最有效的方法[6]。
1.4电子克隆近年来又兴起一种新的基因克隆方法--电子克隆,它是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法,它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术,借助电子计算机的巨大运算能力,通过EST或基因组的序列组装和拼接,利用RT-PCR的方法快速获得功能基因,具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点[7]。
1.4.1利用EST数据库信息首先选择感兴趣的水稻, EST作为查询探针,搜索水稻dbEST数据库,找到部分重叠的EST进行拼接,然后再以拼接好的EST重叠群为新的查询探针,继续搜索dbEST库,直到没有新的EST可供拼接为止,最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物,通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证[7]。
图1为利用EST数据库信息克隆水稻功能基因的试验流程。
图1 利用水稻EST数据库进行电子克隆的策略1.4.2利用基因组信息利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制:可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST或全长cDNA序列作为信息探针搜索位于GenBank或者我国华大公布的水稻基因组序列: 随后根据内含子的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测: 可以得到该基因完整的开放读码框,根据拼接的序列结果设计PCR引物: 进一步采取RT-PCR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定[7]。
具体实验流程见图22 生物信息学分析生物信息学(bioinformatics)是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科,是为理解各种数据的生物学意义,运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学[8-10]。
由于历史原因,有的研究者也使用计算生物学(computational biology)或计算分子生物学(computational molecular biology) 等不同的术语。
在后基因组时代,生物信息学的研究内容主要可分为两个重要组成部分:基因组信息学和蛋白质组信息学[11]。
后基因组时代,除了继续序列和结构分析外,更多的研究力量则投入到功能分析,也就是分析研究遗传型到表型的过程[12]。
2.1 基因序列同源性比对及其应用基因序列同源性的比对,对于分析基因组DNA序列以及完成新基因的染色体定位也是极为便捷的。
将确定的新基因的编码基因序列作为参照,对于GenBank数据库中高通量基因序列(htgs)数据库中基因组DNA序列进行同源性对比,当发现与新基因的cDNA序列完全同源的基因组DNA序列时,根据Chambon原则,内含子(intron)的序列总是以GT开始,以AG结束,就可以确定该基因的基因组DNA序列的结构,及外显子(exon)-内含子序列结构。
因为在htgs 数据库收录的基因组DNA序列,其染色体的来源是十分清楚的,因此就很容易、很方便地将该基因组进行染色体的定位,而不再需要进行荧光原位杂交(FISH)的常规的基因染色体定位技术。
可见基因的生物信息学技术的发展对于基因组DNA序列的确定和在染色体上的定位是多么重要。
迟光红等在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。
用NCBI Blastx分析,得出它具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域,并与其他植物中柠檬酸合酶基因的同源性较高,进一步证明了该cD NA编码香蕉中的柠檬酸合酶[13]。
李学农等通过Internet查询美国国家生物信息中心数据库,数据库采用BLAST,依据Genecard和Ense- mbl获得将MGC39325基因定位于人染色体8q12[14]。
2.2 结构分析与功能预测结构分析的研究重点在于研究蛋白质的空间结构。
利用分子模拟技术结合计算机图形技术可以更形象、更直观地研究蛋白质等生物大分子的结构,蛋白质的空间结构的更清晰的表述和研究对揭示蛋白质的结构和功能的关系、总结蛋白质结构的规律、预测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等,都是有力的帮助和促进。
同时,也可以对已经被测定的生物大分子的三维结构进行显示和编辑操作。
分子模型的建立为下一步进行的分子模拟以及了解结构与功能的关系打下了基础。
蛋白质结构预测是利用已知的一级,二级序列来构建蛋白质的立体结构模型,对蛋白质进行结构预测需要具体问题具体分析,在不同的已知条件下对于不同的蛋白质采取不同的策略。
杨波等以LRP16 基因转录产物为目标序列,在人类基因组数据库中搜索开放阅读框(ORF),利用计算机辅助系统预测LRP16蛋白的一级结构、二级结构和三级结构;利用结构域搜索LRP16 编码蛋白的同源或相似结构蛋白[15]。
2.3 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析将推导出的蛋白质序列登录到NCBI网站( http://www.ncbi.nlm.n ih.gov /)上,用BL AST程序进行序列的同源性检索[16-18]。
王安娜等。
结果发现大豆的C4H蛋白质与绿豆、马铃薯、棉、辣椒、橄榄、烟草、律草属啤酒花等的C 4 H 蛋白质有着很显著的同源性。
在BLA ST p分析的基础上,选择与其同源性较高的几条序列做聚类分析,对C4H蛋白和其他C4H蛋白的同源性做进一步分析。
在DNAMA N 6.0 的Treeview显示的结果。
结果表明大豆C4 H和绿豆的C4H 亲缘关系最近,同源性达95%,来自于同一个分枝;其次是紫苜蓿、红车轴草、鹰嘴豆、豌豆,来自同—个次分枝[19]。
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