乳腺癌细胞培养

乳腺癌细胞原代培养及对六种抗癌药物的体外敏感性研究的开题报告一、研究背景与意义乳腺癌是世界性常见肿瘤，其发病率和死亡率逐年增加，给人们的生命、健康和家庭带来了巨大威胁。

目前，乳腺癌的早期诊断、治疗和临床应用的研究已成为医学界的热点，因此，研究乳腺癌细胞的体外培养及抗癌药物对其的敏感性，具有重要的临床意义。

二、研究目的本研究旨在通过乳腺癌细胞原代培养的方法，构建体外的乳腺癌模型，通过对其对六种抗癌药物的敏感性评价，为肿瘤的科学研究及临床治疗提供参考依据。

三、研究内容1. 乳腺癌组织切片制备及细胞原代培养技术的优选；2. 体外诱导乳腺癌模型的构建与鉴定；3. 采用MTT法对该模型对六种抗癌药物（如紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、氟尿嘧啶、多柿酸钠和替吉奥）的体外敏感性进行测定；4. 对实验结果进行数据统计、分析和表达。

四、研究方法1. 人乳腺癌组织块的采集：收集手术中取出的恶性肿瘤组织块；2. 细胞原代培养：采用组织切片法与酶消化法将肿瘤组织分离为单个细胞，接种紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、氟尿嘧啶、多柿酸钠和替吉奥等六种抗癌药物，将其接种至体外诱导乳腺癌模型的培养基中；3. 体外诱导乳腺癌模型的构建与鉴定：根据细胞培养特征，诱导细胞形成球体、乳头状突出物等形状，确立肿瘤细胞典型形态和生化指标；4. 采用MTT法对该模型对六种抗癌药物的体外敏感性进行测定；5. 对实验结果进行数据统计、分析和表达。

五、研究预期结果本研究将为乳腺癌细胞原代培养及其对六种抗癌药物的敏感性评价提供有效的实验方法和技术路线，同时，通过对体外诱导乳腺癌模型的构建及对其抗癌药物的敏感性评估，为乳腺癌的早期诊断和临床治疗的发展提供理论依据和实验数据参考。

北京索莱宝科技有限公司
人乳腺癌细胞；MCF7贴壁培养
细胞名称：人乳腺癌细胞；MCF7
形态特性：上皮细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：高糖DMEM，10%FBS
传代方法：1:3传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。

该细胞含有Tx-4癌基因。

肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。

抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。

细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。

2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。

细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。

3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。

注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。

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专利名称：一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法专利类型：发明专利
发明人：焦春伟,谢意珍,梁慧嘉,陈家明,邓初夏
申请号：CN202210155316.2
申请日：20220221
公开号：CN114525251A
公开日：
20220524
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法。

将液氮储存的MCF‑7细胞经解冻后加入完全培养基混匀，然后转移到培养皿中放入二氧化碳培养箱培养；将培养后的细胞用PBS溶液清洗，加入消化液消化，使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3D培养基，转移到超低吸附细胞培养板上放入二氧化碳培养箱培养至显微镜下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的MCF‑7细胞球，3D乳腺癌细胞的体外培养成功。

本发明培养方法基于肿瘤细胞培养技术，采用商品化的超低吸附细胞培养板，寻找到了显著提高3D乳腺癌细胞培养效率、操作简单且成本较低的技术途径。

申请人：广东粤微食用菌技术有限公司
地址：510663 广东省广州市黄埔区(广州高新技术产业开发区)神舟路792号
国籍：CN
代理机构：广州弘邦专利商标事务所有限公司
代理人：程长文
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231细胞在含有10%太牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃
、5%CO2培养箱中常规培养，用含0.02%EDTA的胰酶消化传代。

实验分组如下：
对照组：细胞中加入含有0.1%DMSO培养液
实验组：细胞用不同浓度芹菜素（20、40、80、160µmol/L及半数IC5038.1µmol/L）处理。

1.2.2芹菜素对MDA-MB-231细胞增殖的影响
1.取处于对数期生长期的MDA-MB-231细胞常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基配置成5.0×104个/mL细胞悬液。

2.每孔接种100℃µL细胞悬液，每浓度设6个平行样，在37、5%CO2培养箱中培养过夜。

3.吸出培养液，每孔加入含有0、20、4、80、160µmol/L的芹菜素RPMI 1640培养液200µL，在37、5%培养箱个、分别培养24h，48h、72h后加入MTT（5g L-1）20µL，继续培养4H 后吸出上清，每孔加入DMSO150微升，震荡溶解10分，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，以试剂对照组调零，测定各孔吸收值OD
4.细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%
生长抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%
IC50值用Logit法计算：
IgIC50=xm*I（p-pm-pn）/4)，设xm=ig最大剂量，I=IG(最大剂量/相邻剂量)，P：阳性反应率之和，pm：最大阳性反应率，pn:最小阳性反应率。

1.2.3光镜形态学观察
1.。

1、MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能长得很好。

一般两到三天传一代。

传代也很常规。

吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。

再加入2ml胰酶（25ml 培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。

我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。

因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。

需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。

2、MCF-7/ Adr 耐药细胞在培养时逐步加入至终浓度为8µmol/ L的阿霉素以维持抗药性, 实验前2周无药培养。

细胞与分子生物学乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨刘丹阳1，王璐璐2，何军2，姜杨2，李永涛2，张晓东2，李鹏辉2，沈雷2△摘要:目的探讨MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液对人脂肪间充质干细胞（hAdMSC）迁移、增殖和凋亡的影响及分子机制。

方法将MDA-MB-231细胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培养基以1∶4的体积比混匀后培养的hAdMSC为MDA-MB-231上清液组。

向MDA-MB-231上清液组添加10µmol/L Reparixin（CXCR1/2抑制剂）为CXCR1/2抑制剂组；向MDA-MB-231上清液组添加10nmol/L GSK690693（Akt抑制剂）为Akt抑制剂组。

无任何刺激进行培养的hAdMSC为对照组。

细胞划痕实验检测各组hAdMSC的迁移能力，CCK-8实验检测各组hAdMSC增殖情况，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组hAdMSC凋亡率，Western blot检测各组hAdMSC的mTOR/磷酸化mTOR（p-mTOR）和Akt/磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达。

结果与对照组相比，MDA-MB-231上清液组hAdMSC的24h和48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增加，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与MDA-MB-231上清液组相比，Akt抑制剂组和CXCR1/2抑制剂组hAdMSC的48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低，细胞凋亡率均增加（P＜0.05）。

结论MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液通过激活Akt-mTOR信号通路促进hAdMSC迁移和增殖，抑制hAdMSC凋亡，其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。

关键词：乳腺肿瘤；细胞迁移；细胞增殖；肿瘤微环境；脂肪间充质干细胞中图分类号：R737.9文献标志码：A DOI：10.11958/20230255The mechanism of breast cancer cell culture supernatant promoting migration andproliferation of human adipose mesenchymal stem cellsLIU Danyang1,WANG Lulu2,HE Jun2,JIANG Yang2,LI Yongtao2,ZHANG Xiaodong2,LI Penghui2,SHEN Lei2△1Department of Histology and Embryology,2Medical Research Center,Qiqihar Medical College,Qiqihar161006,China△Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To explore the effect of MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant on migration, proliferation and apoptosis of human adipose mesenchymal stem cell(hAdMSC)and its molecular mechanism.Methods hAdMSC cultured from MDA-MB-231cell supernatant and RPMI-1640medium without fetal bovine serum were mixed at a volume ratio of1∶4to form the MDA-MB-231supernatant group.CXCR1/2inhibitor group was added with10µmol/L Reparixin(CXCR1/2inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.The Akt inhibitor group was added with10nmol/L GSK690693(Akt inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.hAdMSC cultured without any stimulation was used as the control group.The migration ability of hAdMSC in each group was detected by cell scratch assay.hAdMSC proliferation was detected by CCK-8assay.Annexin V-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect hAdMSC apoptosis rate in each group.The protein expression levels of mTOR/phosphorylated mTOR(p-mTOR)and Akt/phosphorylated Akt(p-Akt)in hAdMSC of each group were detected by Western blot assay.Results Compared with the control group,the24h and48h scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR protein of hAdMSC were increased in the MDA-MB-231supernatant group,and the apoptosis rate was decreased(P＜0.05).Compared with the MDA-MB-231supernatant group,the48h cell scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR proteins of hAdMSC were decreased in the Akt inhibitor group and the CXCR1/2inhibitor group,and the apoptosis rate was increased(P＜0.05).Conclusion MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant promotes hAdMSC migration and proliferation and inhibits hAdMSC apoptosis by activating Akt-mTOR signaling pathway,in which IL-8-CXCR1/2axis plays a key role.Key words:breast neoplasms;cell migration;cell proliferation;tumor microenvironment;adipose derived mesenchymal stem cells基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（2020-KYYWF-0010）；齐齐哈尔市科技计划联合引导项目（LHYD-2021002）作者单位：1齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室（邮编161006），2基础医学科研中心作者简介：刘丹阳（1982），女，讲师，主要从事肿瘤微环境与肿瘤生物学方面研究。

常见几个乳腺癌细胞的表达的基因及培养展开全文三连一下，了解更多精彩内容乳腺癌(mammary carcinoma)是女性最常见的恶性肿瘤之一。

因地理环境、生活习惯的不同...40%～50%的乳腺癌含有孕激素受体（PR），这类乳腺癌称为PR阳性乳腺癌。

实验常用的乳腺癌细胞有:MCF-7，MCF-10A，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-435S，MDA-MB-436，MDA-MB-453，MDA-MB-468，MDA-MB-157，MDA-MB-361，SK-BR-3，SUM159PT，T-47D，ZR-75-30，ZR-75-1，Hs 578T，HCC1937，HCC 38，HBL100，BT-549，BT-474，BT-20，Bcap-37，DU4475等等。

不同的细胞株所表达的基因都会不同，以下，是我们整理的这些常见的细胞所表达的基因，也是我们公司可以提供的乳腺癌的细胞种类，乳腺癌研究方面的老师记得收藏哦：部分细胞形态细胞名称来源/形态培养基细胞表达BT-20腺癌细胞浸润性导管癌乳腺/上皮细胞样培养基：90%MEM 10%FBSG/A完全培养基：MEM完全培养基（货号：MD0301）气相：37℃, 5% CO2ER(-); PR(-);TP53 WT贴壁生长；该细胞表达WNT3和WNT78。

TNFalpha抑制该细胞生长。

该细胞雌激素受体阴性，但表达5＇外显子缺失的雌激素mRNA。

BT-474导管癌细胞乳腺;乳房/导管；上皮细胞样培养基：90%1640 10% FBSG/A完全培养基：1640完全培养ER( ); PR( );HER2( )；TP53浸润性导管癌 基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2BT-549 导管癌细胞 乳腺；乳房/上皮细胞 培养基：90%1640 10% FBS G/A 完全培养基：1640完全培养基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2ER(-); PR(-);TP53 WTHBL100胸腔积液 培养基：DMEM 基础培养基 , 90%；胎牛血清，10%。

乳腺癌细胞三维培养模型构建及其药物敏感性研究姜昊声;曹燕;吴绍秋;刘冰妍;贾一平;王振磊;尚鸣异【摘要】目的：观察乳腺癌MCF-7细胞在3D与2D培养模式下对阿霉素的敏感性。

方法应用模板印制凝胶微孔支架技术建立体外3D细胞培养模型，通过倒置显微镜等方法观察3D细胞球的生长特性；采用AlamarBlue法获得不同培养模式下药物阿霉素作用的细胞抑制率；采用流式细胞术比较2D培养和3D培养细胞周期、细胞凋亡的差异。

结果3D与2D培养相比，G1／G0期胞增多，S期、G2／M期细胞减少，细胞周期受阻滞，具有统计学差异（P＜0．05）；活细胞减少，早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞比例增大（ P＜0．05）。

阿霉素作用3 d后，3D培养细胞的IC50值为23．77μg／ml [95％CI 15．80～35．77]，2D培养细胞的IC50值为0．46μg／ml （95％ CI 0．28～0．75），MCRI为51．7。

结论3D 培养MCF-7细胞在细胞周期、细胞凋亡等方面与2D培养细胞存在明显差异，可能是导致乳腺癌多细胞耐药的重要原因。

%Objective To observe the changesof sensitivity to doxorubicin on breast adenocarcinoma MCF -7 cells cul-tured as 3 dimensional model or monolayer .Methods MCF-7 cells were cultured as 3 dimensional model using agarose scaffolds with highly ordered micro-wells.The spheroid growth characterization was observedby invert microscope .The sensitivity to doxoru-bicin on MCF-7 spheroidsor monolayers was determined by AlamarBlue assay respectively .Cell cycle and apoptotic rate were de-tected by flow cytometry.Results For 3D spheroid culture,the proportion of cells in G0 ~G1 phase was higher,while the propor-tion of cells in S phase and G2-M phase were lower than the2D culture(P<0.05).The cell viability declined in 3D culture than the 2Dcontrol,and the proportion of cells in the early-apoptotic,late-apoptotic phase increased significantly (P<0.05).After 3 days of DOX treatment,the IC50 value obtained for spheroid culture was 23.77μg/ml [95%CI15.80~35.77],relative to 0.46μg/ml (95%CI 0.28~0.75) for the monolayer culture .The MCRI value was 51.7.Conclusion There are significant differ-ences in cell cycle and apoptotic rate between MCF-7 spheroids and monolayer ,which may be the important causes of the multi-cellular resistance of breast carcinoma .【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2016(031)006【总页数】4页(P871-874)【关键词】乳腺癌;肿瘤多细胞球;3D培养;阿霉素;抗药性【作者】姜昊声;曹燕;吴绍秋;刘冰妍;贾一平;王振磊;尚鸣异【作者单位】200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院【正文语种】中文【中图分类】R737.9近年来，3D细胞培养在药物研究和生物学研究中的应用越来越广泛。

4t1细胞培养方法
4T1细胞是一种乳腺腺癌细胞系，以下是4T1细胞培养方法：
1. 4T1细胞培养基的制备：将DMEM培养基中加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。

2. 培养器皿的涂层：使用0.1%胶原酶涂层25 cm2培养瓶。

3. 细胞的接种：将4T1细胞在对数生长期用PBS洗涤一次，用新鲜细胞培养基将细胞重新分散，最后接种在涂层好的培养器皿中。

4. 细胞的培养：将培养器皿放入37℃、5%CO2恒温培养箱中，每3-4天更换一次细胞培养基，直到细胞密度达到80%-90%时进行细胞的传代。

5. 细胞的传代：用1x trypsin-EDTA液将细胞亚培养到
2.5~5.0×10^5/ml后进行传代，将细胞重新接种在涂层好的培养器皿中，依照上述方法继续培养。

6. 注意事项：细胞的传代次数不得超过15次，一旦发现细胞出现异常或者有感染的情况，应及时停止培养。

MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。

一般两到三天传一代。

传代也很常规。

吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。

再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。

我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。

因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。

需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。

MDA-MB-231人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称 MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。

该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因培养基 L15: Leibovitz Medium血清 10%FBS细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次细胞传代情况 C5细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件:37℃ 5% CO2消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min传代的比例:1:2~1:4换液时间:2~3天换液一次冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。

细胞培养密度对乳腺癌４Ｔ１细胞增殖、迁移、黏附及浸润能力的影响陈腾祥１，孙密欣１，２，肖俊３，董宇华１，熊英１，兰金芝１，雷珊１，张金娟１（１．贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳　５５００２５；２．河北省邯郸市第一医院中心实验室，河北邯郸　０５６０００；３．贵州医科大学生物与工程学院，贵州贵阳　５５００２５）［摘　要］目的：探讨细胞培养密度对乳腺癌４Ｔ１细胞增殖、迁移、黏附及浸润能力的影响。

方法：取乳腺癌４Ｔ１细胞，培养至汇合度为６０％（低密度培养组，ｓｐａｒｓｅ组）和９０％（高密度培养组，ｄｅｎｓｅ组），两组取相同数量的４Ｔ１细胞，采用克隆实验检测两组细胞的克隆形成数目，采用划痕实验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室跨膜迁移实验检测４Ｔ１细胞的迁移率，采用黏附实验检测细胞的黏附率，采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ细胞浸润实验检测４Ｔ１细胞侵袭能力。

结果：克隆实验结果显示，与ｓｐａｒｓｅ组比较，ｄｅｎｓｅ组的４Ｔ１细胞形成克隆数目明显增多（Ｐ＜０ ０１），且形成的单个克隆面积更大；划痕实验结果显示，与ｓｐａｒｓｅ组比较，ｄｅｎｓｅ组４Ｔ１细胞划痕愈合率显著升高（Ｐ＜０ ０１）；Ｔｒａｎ ｓｗｅｌｌ小室跨膜迁移实验结果显示，ｄｅｎｓｅ组４Ｔ１细胞迁移率明显高于ｓｐａｒｓｅ组（Ｐ＜０ ０１）；黏附实验结果显示，ｄｅｎｓｅ组４Ｔ１细胞的黏附率明显高于ｓｐａｒｓｅ组（Ｐ＜０ ０５）；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ实验结果显示，ｄｅｎｓｅ组４Ｔ１细胞的浸润能力明显高于ｓｐａｒｓｅ组（Ｐ＜０ ０１）。

结论：高密度培养能够明显增强乳腺癌４Ｔ１细胞的增殖、迁移、黏附和浸润能力。

［关键词］细胞，培养的；乳腺肿瘤；细胞密度；增殖；转移；黏附；浸润［中图分类号］Ｒ７３；Ｒ３６３ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］２０９６ ８３８８（２０２０）０８ ０９０９ ０５ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．２０９６ ８３８８．２０２０．０８．００８ＥｆｆｅｃｔｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＤｅｎｓｉｔｙｏｎｔｈｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ＡｄｈｅｓｉｏｎａｎｄＩｎｖａｓｉｏｎｏｆ４Ｔ１ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＣｅｌｌＬｉｎｅＣＨＥＮＴｅｎｘｉａｎｇ１，ＳＵＮＭｉｘｉｎ１，２，ＸＩＡＯＪｕｎ３，ＤＯＮＧＹｕｈｕａ１，ＸＩＯＮＧＹｉｎｇ１，ＬＡＮＪｉｎｚｈｉ１，ＬＥＩＳｈａｎ１，ＺＨＡＮＧＪｉｎｊｕａｎ１（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｎｄａｎＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｎｄａｎ，０５６０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，５５００２５，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｄｅｎｓｉｔｙｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ４Ｔ１ｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｓａｍｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ４Ｔ１ｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆ６０％（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙｇｒｏｕｐ，ｓｐａｒｓｅｇｒｕｏｐ）ａｎｄ９０％（ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｇｒｏｕｐ，ｄｅｎｓｅｇｒｏｕｐ）ｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｆｏｒｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃａｓｓａｙｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｆｏｒｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇａｓｓａｙａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｔｏｍｅａｓｕｒｅｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｆｏｒａｄｈｅｓｉｏｎｔｅｓｔｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅ，ａｎｄｆｏｒＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｐａｒｓｅｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒａｎｄｔｈｅｓｉｚｅｏｆｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓ，ｔｈｅｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇｒａｔｅ，ｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｄｅｎｓｅｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｓｉｍｉｌａｒｌｙ，ｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｄｅｎｓｅｇｒｏｕｐｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｓｐａｒｓｅｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｉｎｖａｓｉｖｅａｂｉｌｉｔｙ４Ｔ１ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｇｒｏｕｐｗａｓ９０９第４５卷　第８期２０２０年８月 贵州医科大学学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．８２０２０．８［基金项目］贵阳市科技计划项目［筑科合同（２０１７）５－１１］；贵州省科技厅—贵州医科大学联合基金项目［黔科合ＬＨ字（２０１６）７３５０］通信作者Ｅ ｍａｉｌ：８２６６０９５８５＠ｑｑ．ｃｏｍｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ４Ｔ１ｃｅｌｌｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｃｅｌｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ；ｂｒｅａｓｔｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；ａｄｈｅｓｉｏｎ；ｉｎ ｖａｓｉｏｎ 乳腺癌（ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ）是常见的女性恶性肿瘤，其发病率和死亡率均呈逐年上升趋势［１－２］。

MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。

一般两到三天传一代。

传代也很常规。

吸出培养基，参加％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除剩余的培养基。

再参加2ml胰酶〔25ml 培养瓶〕静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出参加培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。

我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。

因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。

需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。

MDA-MB-231人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称 MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中别离建立的。

该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因培养基 L15: Leibovitz Medium血清 10%FBS细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次细胞传代情况 C5细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞根底培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件：37℃ 5% CO2消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min传代的比例：1：2~1：4换液时间：2~3天换液一次冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度：1-2 ×10 6/管，液氮保存MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37℃水浴中，震荡解冻2min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，参加5ml37℃预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心〔1000rpm，5min〕，弃去上清液，再参加2ml培养基，转入培养瓶中培养。

乳腺癌组织原代细胞安全操作及保养规程背景乳腺癌是一种多发性恶性肿瘤，其发病率逐年上升。

乳腺癌组织原代细胞的培养与研究对于研究乳腺癌的发病机制以及开发相关治疗手段具有重要的意义。

然而，乳腺癌组织原代细胞的培养和操作需要特殊的安全措施，以保证实验人员的安全以及实验结果的可靠性。

安全操作规程实验前准备1.实验前需穿戴实验室专用的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩和护目镜等。

2.准备完整的实验材料和设备，包括培养皿、培养基、培养箱、离心机和显微镜等。

实验操作细胞分离1.将乳腺癌组织样本放入无菌环境中，使用无菌器械进行细胞分离。

2.使用细胞培养基中的酶类，如胰蛋白酶等，进行组织的消化，使细胞得以分离。

3.分离后的细胞通过离心机进行离心，去除上清液，得到细胞沉淀。

培养细胞1.将细胞沉淀用培养基进行悬浮，使细胞均匀分布。

2.将细胞悬浮液转移到培养皿中，一般建议使用培养皿的表面涂层，如胶原蛋白、明胶等。

3.将培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和湿度条件，通常为37摄氏度和5%二氧化碳浓度。

细胞培养条件1.细胞培养基应保持适当的pH值，通常为7.2-7.4，可通过添加缓冲液进行调节。

2.细胞培养箱中的培养基应定期更换，一般为2-3天一次。

3.细胞培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度应保持恒定，避免对细胞生长产生不良影响。

细胞处理与传代1.传代细胞前应检查细胞的状态，如细胞数量、生长形态等。

2.细胞传代前应注意将细胞培养基中的胶原酶等酶完全去除，避免对细胞影响。

3.传代时应进行细胞计数，以确定合适的传代比例，一般为1:3至1:5。

4.传代细胞后，应及时更换培养基，并将细胞培养箱恢复至正常的培养条件。

实验结束1.实验结束后，将培养皿和废弃物器皿等进行消毒处理，避免对环境产生污染。

2.将实验室的工作区域进行清洁和消毒，以确保实验的安全性和整洁性。

保养规程1.定期对培养箱进行维护，清洁箱体和控制系统，确保温度、湿度和二氧化碳浓度的准确性和稳定性。

乳腺癌干细胞的培养及鉴定郑文博;潘凌霄;唐炜;高进;叶熹罡【摘要】Objective To isolate breast cancer stem cells from breast cancer patients and identify their biological characteristics. Methods Mammospheric cells were purified and enriched from the tumor tissues of breast cancer patients using mammosphere culture. Their expressions of CD44 and CD24 were analyzed by flow cytometry, and ALDH1, ESA and Oct4 expressions were determined by Western Blotting. The primary mammospheric and adherent cells, at the density of 2×104, 2×105 or2×106, were inoculated into NOD/SCID mice to observe their tumorigenic and metastatic activities. Results With mammosphere culture method, 62.36% of the mammospheric cells showed CD447 CD24-now phenotype. The expressions of ALDH1, ESA and Oct4 in the mammospheric cells were significantly higher than those in the adherent culture-derived breast cancer cells (P<0.05). Primary mammospheric cells were at least 100-fold more tumorigenic than the adherent cells; the mammospheric cells were associated with liver or lung metastases, but the adherent cells were not. Conclusions Mammosphere culture can be employed to obtain breast cancer stem cells from the tumor tissues of breast cancer patients.%目的从乳腺癌患者的肿瘤组织中获得乳腺癌干细胞,并确定其生物学特性.方法收集乳腺癌患者的肿瘤组织,利用乳腺球悬浮培养法获得乳腺球细胞.用流式细胞仪检测细胞CD44以及CD24的表达,用Western印迹法检测细胞ALDH1,ESA以及Oct4的表达.将2×104、2×105和2×106三种细胞数的原代乳腺球囊细胞及贴壁细胞分别接种到NOD/SCID鼠的脂肪垫,观察其成瘤能力和肝肺转移情况.结果利用乳腺球悬浮培养的原代乳腺癌细胞中有62.36％呈CD44+/CD24-/low表型,且肿瘤干细胞标记物ALDH1,ESA以及Oct4的表达高于贴壁培养的原代乳腺癌细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).与贴壁细胞相比,悬浮培养富集的原代球囊细胞均有更强的成瘤和肝肺转移能力.结论利用乳腺球悬浮培养法可以从人乳腺癌组织中获得乳腺癌干细胞.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)012【总页数】5页(P2021-2025)【关键词】乳腺癌;肿瘤干细胞;乳腺球悬浮培养【作者】郑文博;潘凌霄;唐炜;高进;叶熹罡【作者单位】广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120;广州医学院第一附属医院乳腺外科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R655.8;R737.9近年来研究发现［1］，肿瘤是一种干细胞疾病，是由具有成瘤能力的肿瘤干细胞增殖发育而成的异常组织，肿瘤干细胞在肿瘤的形成和生长过程中起了重要作用。

MCF/Adr人乳腺癌阿霉素耐药细胞Cat Number：KG031-1For Research Use Only一、组成:组份KG031-1细胞一瓶25cm2细胞说明书1份细胞培养注意事项1份二、客户自备试剂:1、PBS(凯基货号：KGB500)2、Complete growth medium(凯基货号：KGM1640SF)3、0.25%（W/V）Trypsin-0.53mM EDTA(凯基货号：KGY001)三、细胞简介:培养基:RPMI-1640+10%进口胎牛血清+1%双抗+1000ng/ml阿霉素消化液0.25%胰蛋白酶+0.53mMol/L EDTA冻存液胎牛血清:DMSO=9:1培养条件二氧化碳培养箱:温度37℃,5%的二氧化碳客户收到细胞后按照下面的要求操作：培养瓶里面的培养液是不含药物的。

待细胞长到70-80%的汇合度时，去掉培养液，加入含500ng/ml阿霉素药物的培养液，放入培养箱，这段时间肯定会有小部分细胞悬浮起来，但是不要紧，通过换液可以去掉，下面的细胞待长满就可以消化传瓶了，这时可以一直用含药培养液来消化培养细胞，一两代之后可以将药物浓度提高到1000ng/ml，含药培养液用于细胞培养都没问题的，冻存的时候就不要在冻存液里面加药物了。

四、常见问题及解决方案:1、培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2、细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。

次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。

本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。

一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。

（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。

普通培养基采纳DMEM，含10％的。

贴壁生长后，2～3天即可传代。

【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。

2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。

3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。

【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。

(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。

(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。

(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。

2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。

(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。

(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。

(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。

乳腺癌细胞株整理docx（一）引言概述：乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其治疗涉及到研究和使用乳腺癌细胞株。

乳腺癌细胞株整理是为了系统化地研究乳腺癌的发生机制以及开发治疗方法的重要工作。

本文档将从以下五个大点出发，对乳腺癌细胞株整理进行详细阐述。

一、乳腺癌细胞株的来源和筛选方法1.常见的乳腺癌细胞株来源2.乳腺癌细胞株的特点和分类3.乳腺癌细胞株筛选方法的原则和步骤4.细胞株的基本鉴定和验证方法5.常用的乳腺癌细胞株库介绍二、乳腺癌细胞株的培养和传代方法1.培养基的选择和制备2.细胞的传代和细胞密度控制方法3.细胞培养的注意事项和问题解决方案4.细胞冻存和解冻方法5.乳腺癌细胞株的病毒污染检测和预防三、乳腺癌细胞株在药物筛选中的应用1.药物筛选的原理和方法2.乳腺癌细胞株的药物敏感性评估指标3.药物筛选实验的步骤和操作要点4.影响细胞药物反应的因素和解决方法5.常用的药物筛选平台和技术进展四、乳腺癌细胞株在基因表达和调控研究中的应用1.基因表达分析的原理和方法2.乳腺癌细胞株的转染和过表达方法3.基因沉默和干扰技术的应用4.表达谱分析和差异基因筛选方法5.研究乳腺癌细胞株基因调控网络的新进展五、乳腺癌细胞株在动物模型研究中的应用1.动物模型构建的原理和方法2.乳腺癌细胞株在裸鼠模型中的应用3.乳腺癌细胞株在转基因小鼠模型中的应用4.评估乳腺癌细胞株在动物模型中的肿瘤形成能力5.乳腺癌细胞株在治疗有效性评估中的作用总结：乳腺癌细胞株整理在乳腺癌研究和治疗中具有重要的意义。

通过筛选、培养和应用乳腺癌细胞株，可以深入研究乳腺癌的发生、发展机制，开展药物筛选和基因调控的研究，以及评估治疗方法的有效性。

随着技术的不断进步，乳腺癌细胞株整理将在乳腺癌领域发挥越来越重要的作用。