碱性磷酸酶的活力测定(修改版)

MAO
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
• ALP几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。
• ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自肝脏， AKP3来自骨细胞，AKP4产生于胎盘及癌细胞，而AKP5来 自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
碳酸盐缓冲 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 液
0.5%铁氰化 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 钾溶液
相当于金氏 0 单位
0.5 10
20 30 40
立即混匀，选择波长510nm，用零号管调零，读 取各管吸光度，然后将以上各管所得读数与其 相应的碱性磷酸酶单位(依次为0 .5、10、20、 30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。
•
• 2.代谢酶：（细胞酶） • 在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些
酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细 胞内、外浓度差异悬殊。 • 当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通 透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血 浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床 意义很少。 • 这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢 酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都 可能出现变化。
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4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血 单击此处可编辑内容，
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伸文本框大小
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血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久 置
计算
• ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白） *0.05*100(金氏单位）
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色， 说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。
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3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体， 止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。
磷酸苯二钠法
• 在pH10环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二 钠。
• 苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化 生成醌衍生物。
• 可根据红色深浅测定酶活性的大小。
磷酸苯二钠+H2O (ALP, PH=10) → 苯酚 + 磷酸氢二钠
4-氨基安替比林（铁氰化钾）+苯酚 → 红色醌亚胺衍生物
• 金氏单位定义
• 每100ml血清在37℃与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个 金氏单位。
• 参考值 成人：3~13金氏单位 儿童：5~28金氏单位
临床意义：
血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
1．血清ALP活性升高可能原因如下 ：①肝胆疾病：阻塞性黄 疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于 骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血 液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、 佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。
叁 ·实验器材与试剂
• （一）器材：
5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式
移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒
温水浴
淡黄色结晶。熔点 109℃。溶于水、苯
和乙醇，微溶于乙
醚。
• （二） 试剂：
1、碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳 酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林 1.5g于蒸馏水800ml中，将此溶液转入1L容量瓶内， 加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。
（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物 的酶量。单位为IU/L 。 • Kat单位：指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶 量，1Kat=6×107IU。
• 酶的活力单位
国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量 临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血
• 对于固定时间法，需在酶作用一段时间后，加入合适的 终止剂终止酶促反应。
• 尽量去除各种抑制剂
• 问题5：
• 如何表示酶活性大小？
酶活性单位
• 定义：
• 在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物 （或得到一定量的产物）所需要的酶量。
• 分类：
• 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 • 国际单位(International unit, IU)：指在规定条件
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有 什么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。
血浆酶的来源
血浆酶
血浆特异酶
外分泌酶
非血浆特异酶
诊断常用血清酶
血清酶 鸟氨酸来氨源基甲酰转移酶 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 肝 谷氨酸脱氢酶 肝 山梨醇脱氢酶 肝 丙氨酸氨基转移酶 肝、肾、心 异柠檬酸脱氢酶 肝、胎盘、心 -谷氨酰转肽酶 肝、胆、肾、小肠 5ˊ-核苷酸酶 肝、胆道 单胺氧化酶
符号 OCT LCAT
GLDH SDH ALT ICD -GT 5ˊ-NT
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种 方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实 验方法）。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对 硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定 在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
• 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 • 1.分泌酶： • 来源于消化腺或源自文库他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶
（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、 胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。 • 正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。 • 在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
引言（2）
• 一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定 位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度 梯度差。
• 正常情况下血浆中酶活性相对恒定。但一些病 理情况常导致血浆中酶活性的改变。性别、年 龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人 血浆中某些酶的生理性变化。
• 所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性 和灵敏度。
3、铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g， 硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后 ，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝 绿色即弃去)。
4、酚标准工本作实液验采（用0终.止法；05终m止g剂/m是l铁）：购买合格的 二级标准品。氰使化其钾不硼再酸处液于；最硼适酸PH改。变了PH，
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P 式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶，
Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同，
Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速 度都可以代表酶活性？
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
• 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
问题1:为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什 么意义？
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪 食物等均可使血清ALP活性增高。
2.病理性改变： • 升高
（1）肝胆疾病。主要见于阻塞性黄疸，急、慢性黄疸 性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高， 其中以癌性梗阻最明显。
• • 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊
断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。
壹 ·实验目的 贰 ·实验原理 叁 ·实验器材与试剂 肆 ·实验操作
壹 ·实验目的
• 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法（磷酸苯二 钠法）
• 掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
贰 ·实验原理
• 测定ALP活性的方法主要分为两种
• 一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如 β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的 缺点
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
•问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
2．血清ALP活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢 性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有一种遗传性低ALP 症，因成骨细胞中缺乏ALP，引起骨中的矿物质严重缺乏， 易发生骨折。
标准曲线法
加入物（ml) 0
12
345
酚标准应用 0 液
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1ml=0.1mg
蒸馏水
肆 ·实验操作
实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。前者是达 到最适温度，后者是反应时间
取试管4支，按下表操作
• 立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水 调零点，读取各管吸光度。 •保持反应时温度是均衡的，37°C
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清在37℃。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1μmol 丙酮酸所需的酶量为1个活力单位
• 酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活 力单位数，即酶活力浓度。
• 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）
C 目 录 O N T E N T S
• 连续监测法： （速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂
用量少，可在较短时间内完成测定。
酶偶联测定法
2、20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿 2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再 倒回瓶中）
4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰 化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾 用量必须加足或稍稍过量
酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择
• 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间