液相的常见问题：
一、在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下波动）的原因，可能有以下几种：
1、柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如二元流动相：甲醇：水，乙腈：水，，，，，，）
2、系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏
3、PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑是PUPM 头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。
4、流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线肯定是不稳的
5、柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动。
6、PUMP密封不好。密封不好，也会导致PUMP头的气泡（好象不可能）和漏夜，基线当然不稳定了。
7、系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化，，，，，，，以及梯度洗脱，当然基线漂移
8、单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力波动。故也会波动，漂移
9、检测器污染或有杂质
10、如果是紫外或二极管阵列检测器（PDA），排除以上原因还出现基线噪音大，就有可能是氘灯的能量不足了
二、主峰后面有很多杂质峰可能原因
1，仪器问题：最有可能的就是系统污染，尤其是管路，比如，入口单向阀或各接口处等有盐残留；
2，色谱柱问题：这个好办，换新的色谱柱，大部分能解决问题；
3，试剂试药问题：所用试剂、试药达不到色谱级别所需，或者不同批号不同厂家的东西都有可能影响，最直接影响的就是物质的纯度影响流动相的吸收；4，梯度洗脱程序：梯度洗脱程序设置不合理，比如在某个时间段急剧变化；5，其他：如配制方法不同，超声方法不同等。
如今，看似很简单的问题，在经过很长一段时间的摸索后发现，上述原因其实都是比较客观的，如果以上4点都解决不了，可以考虑以下原因：仪器本身功能上的区别导致。比如安捷伦低压梯度和高压梯度做的同样的东西，能重复出来，而且梯度峰都很小，甚至没有，而用岛津的低压和高压梯度仪器，所表现的就不一样了，具体原因，因只具有经验所得，所以目前只能作为讨论的一个话题，仅供各位参考。
三、冲洗液相管路
1、如果系统污染可以考虑用异丙醇冲洗，把过滤后的异丙醇当流动相，以0.5ml/min冲洗30-60分钟，一般杂质就可清除。如果不行可以考虑12%的磷酸冲洗，它可以有效清洗不锈钢和其它材料的管路，清除有机杂质及污垢，比用有机溶剂更有效，也比用稀硝酸有效（用5-15%硝酸清洗虽然有效，但是清洗后系统很难平衡，特别低紫外区域）。磷酸清洗方法如下：先用甲醇或者乙腈彻底清洗系统，然后是纯水，然后是12%磷酸冲洗60分钟左右，冲洗过程中可以将进样器一并冲洗，然后换用水，甲醇或乙腈冲洗，这样就基本可以了。
2、用5%硝酸洗脱管路1h后未知峰去无踪，效果不错，推荐大家有必要试
试
如果不是污染严重，还是别用硝酸洗脱管路，因硝酸对不锈钢管路损害较大
四、梯度洗脱
做梯度洗脱有时候是会这个样子的，基线会漂移的满厉害的。要用足够的时间来平衡，如果有在线脱气装置会好一点。特别是走梯度洗脱时后面往往有一些杂峰而有机相在不同的比例下吸光度也不一样，由于UV检测的是相对吸收度，所以就造成了基线漂移。而且，如果柱子没有平衡好，这种漂移也不一样。如果走上两个小时后，这种漂移相对就稳定。在梯度分析时，流动相的选择和波长的选择是很重要的；在梯度洗脱时，一般波长不应再变，否则再高的水平也做不好，尤其在低波长时。
分析波长较高时，流动相相对容易些，如在300nm以上，影响相对较小。但是，在大多数的情况下，流动相首选低紫外吸收的，如乙腈和水，少用甲醇和四氢呋喃，无机盐以磷酸盐等低紫外吸收的为好，少用醋酸盐、柠檬酸等有机盐，酸用磷酸和硫酸少用醋酸，同时梯度变化尽可能小和缓和，虽然分析时间将增加。另外，A，B（C）相都采用混合流动相，以减少流动相变化对紫外的影响。还有一点，所用的试剂要求为色谱纯，国内有的厂家所标的色谱纯连化学纯的都不如，有一些特定的添加试剂，如离子对试剂，只能使用进口的色谱纯级。注意以上几点，你的梯度色谱图必将大有改观。当然你的仪器也要好的了。
建议您使用一种方法：扣除本底法。此种方法由色谱工作站来完成，具体方法是：1、不进样，严格按梯度方法空跑出基线，得出不进样的梯度基线。2、进样，做梯度洗脱，得到谱图。3、在工作站上用谱图相减的功能处理，用谱图减去梯度基线，即可得到比较漂亮的谱图，而且不影响定量计算！
五、样品池污染
1、如果是流通池脏，可以把柱子去下来，用50－50（v/V)的异丙醇、异丙醇纯水、来冲洗流通池。如果还不行，用1N的硝酸冲流通池，再用纯水冲洗。https://www.doczj.com/doc/4f15637606.html,/bbs/thread/6935925?keywords=样品池污染#6935925
2、液相管路脏、样品池脏、样品池能量比参比池低很多，处理方法：不接柱子，接上二通管，用8%硝酸冲洗2小时，纯水冲洗2小时，用甲醇过度，接着用异丙醇冲洗2小时，最后过度成甲醇。结果：基线平稳，峰行明显改善，样品池能量恢复
六、异丙醇的作用：
在安捷伦液相中会使用的10％异丙醇，它的作用是柱塞清洗附件的清洗液，它主要是当流动相中含有盐类时，为了防止盐类在柱塞产生结晶，磨损宝石杆和柱塞密封圈，加入异丙醇10％异丙醇一方面有防止长菌的作用，另一方面有增加清洗液的润湿性，减少泵内气泡产生。在泵运行的时候一定不能干。异丙醇是一个很特殊的角色，是维护液相的专业溶剂，它的“露面”至少有以下几处：
1、10%的异丙醇是柱塞清洗附件的清洗液。
2、更换密封圈后用异丙醇磨合。
3、洗针用溶剂。
4、峰拖尾时，可尝试用异丙醇冲柱子。
5、泵的压缩性补偿值，是以异丙醇为基准：标准的100，而常用的流动相：甲醇120，乙腈115，而水则偏差较大，是46。
6、正相和反相系统转换时的中间过度溶剂。
另外在其他厂家的液相中使用30％甲醇，作用都是和异丙醇的一样，用于洗泵和洗针。
七、检测限与定量限
S/N=3时的浓度是检测限，也就是峰高约在基线噪音高的3倍，注入液相色谱仪的对照品百分浓度％。S/N=10是定量限，也就是峰高约在基线噪音高的10倍时，注入液相色谱仪的对照品量。首先，配制一个较低浓度的对照品溶液，注入液相色谱仪，观察其峰高比基线噪音高多少倍（假设X倍），将该溶液稀释到X/3倍，基本即为该物质的检测限，将该溶液稀释到X/10倍，基本即为该物质的定量限。
在新的“指导原则”中提到了检测限和定量限，以检测限为例：“检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。”“无论用何种方法，均应用一定数量的样品，其浓度为近于或等于检测限，进行分析，以可靠地测定检测限。”其中第一句中指出是最低量，但第二句中又类比为浓度，所以，可以看出，官方对这个概念的定义也不是很严格。另外，在报新药时，可同时写入申报资料，如标题是：检测限的测定；结果中写：最低检测量是xx ng，最低检测浓度是xx ug/ml。这样就不会因为概念出问题了。（我们就是这样做的）而最低检测量就是最低检测浓度乘以进样量，写明任一个结果均可。不会被认为是错误的。个人认为，审评人员看中的是你对问题的解决途径，就是说问题是否被很好解决了，对于结果的撰写形式，倒是很少那么较真吧。因为他自已也不能准确地定义，呵呵。
我个人认为噪音峰不应该计最大的，而应该以出现频率最多的信号计，如果以最大的噪音峰来计，检测限会偏大的。我平时做检测限的时候通常是在做有关物质自身对照溶液线性的时候，选取浓度最低的样品稀释进样，我的经验是：这样做稀释的次数要少，且好计算。如果没有目的地一针一针的试，通常到最后就已经没有浓度的概念了。记得，我刚入行的时候，跟着老师做，检测限，她只告诉我做到S/N=3。然后，我就这么茫目的稀释，光那个检测限，我就做了大半天。现在想起来都觉得糗。
检测限(limit of detection，LOD)当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到S／N＝2或S／N＝3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3δ空或3S空)作为检测限的估计值。定量限(limit of quantitation，LOQ)将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。
八、PPM
简单的说：1ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6 常用来表示气体浓度，或者溶液浓度。ppm是英文parts permillion的缩写，译意是每百万分中的一部分，即表示百万分之（几），或称百万分率。如1ppm即一百万千克的溶液中含有1千克溶质。ppm 与百分率（％）所表示的内容一样，只是它的比例数比百分率大而已。在花卉生产栽培中，常常施用“微肥”和“植物激素”，这些药剂在施用时，其用量甚微，每千升的容量中只含有几毫克甚至更少，故用“ppm”
来表示。
九、紫外扫描定检测波长
方法一:波长扫描，找最大吸收不就行了，一般是扫描，取最大波长。
办法二:如果测有关物质，一般选择254。如果测含量，一般选择最大吸收波长。
方法三:一般的液相上具有二极管阵列检测器的,都可以进行波长扫描,以取得最大吸收峰,如果没有这种功能的,可以从254开始,每格5或10的波长进行增加寻找,可以比较麻烦,也是没办法的办法.当然了,最好要有纯物质,这样比较准确点.
方法选择问题:比如,流动相配制\流速\取样量\波长\溶剂选择,以及检测器的选择等,都是要考虑的问题.
如果没有那种功能，可以用紫外扫描仪扫描，这样就可以找到最大吸收波做波长扫描是最简单的方法,如果不成,可以判断样品中的特定官能团,查相关文献,会有对此官能团的最大吸收波长,以其做参考,在其波长附近.做几个相差5或10nm的..
一般不论实验是测含量还是有关物质,波长选择都先用流动相配制样品扫一张紫外图谱,初步确定最大吸收波长,以作参考.
而真正选择哪个作为检测波长还需在液相上试.因为往往与紫外扫描有差异.影响因素很多,样品的浓度差异,液相上流动相有时是双泵混合而得与手动配制也有一定的差异...
含量测定一般选用液相上待测成分吸收最大的波长,因为此时灵敏度最大,误差相对小.但若1.其最大吸收波长是比较靠近200nm,由于溶剂截止波长的影响当然也可适当将波长往长波方向移;2.有时需同时测定多种成分,且最大吸收波长差
异又较大,为兼顾也可选择中间波长.
有关物质的波长选择因是检测有关物质且常常量小,一般是选用有关物质的最大吸收波长.同样也存在为方便同时检测多个有关物质而选用中间波长的情况. 有关物质的情况比较复杂,在未知有关物质数目种类的条件下最好能用二极管阵列检测器,以防止在某些波长下,有些又不容忽略的有关物质不被显示而漏检.
总之,二极管阵列检测器的用处比较大,我也是用后深有体会.波长选择百变不离其中的是应符合方法学上的要求.
https://www.doczj.com/doc/4f15637606.html,/bbs/topic/21305756
我们初步选定最大吸收波长的方法：先按药典两种药物项下用甲醇作溶剂，然后用原料配制混合的对照溶液，用对照容易在紫外光度计上从200-400进行全波长扫描（每隔10nm扫描一次）找出最大的吸收波长，然后用初步确定的最大吸收波长在液相上进行实验看峰的峰型如何，如果峰型不太好我们可以根据紫外扫描的结果进行适当的调整。
本文档部分内容来源于网络，如有内容侵权请告知删除，感谢您的配合！
液相常见问题汇总 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT
常见色谱分析问题解疑 一、产生前沿和拖尾的原因一般有哪些 （1）拖尾： 1.干扰峰，优化条件分离2色谱柱塌陷，更换色谱柱3流动相pH 不合适，调节pH值4管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下 （2）前沿： 1溶剂选择不合适，选择合适的溶剂2样品过载，降低进样量3柱温太低，升高柱温4色谱柱损坏，更换色谱柱5干扰峰，优化色谱条件分离 可能的问题：1.柱子问题2.流动相不恰当3.定容样品的溶剂不合适 产生峰前沿的原因：柱过载，柱头塌陷，溶剂选择不对 产生峰拖尾的原因：存在杂质未分开，柱污染，柱子选择不对。 拖尾峰与柱子有关，可能是过载，稀释样品再做，或换新柱做吧 一般产生托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，可以优化分析方法，或更换柱子试一试；也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因；再有也会根样品本身性质有关，基团需要流动相中
添加能与之结合优化峰形的化学物质，要根据具体情况而定。柱子可能污染了吧，溶剂也可能有，或柱效下降。 图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适，可以相应调整流动相的极性，或者适当加入酸来调整，可以得到较好的改善。一般来讲，酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。 柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染，选择合适的流动相，调节好PH能够改善这以情况。 二、怎样避免拖尾和前沿，有何措施 选择合适的色谱条件和色谱柱，就可以避免峰拖尾和前沿 在处理样品时选择合适的流动相最为重要，所以在实验设计时充分了解所要分离的物质的化学性质和溶解度、极性等相关问题，摸条件时找到较好的流动相，是避免拖尾峰出现的最好方法。 避免拖尾和前沿主要要控制好溶质的量，每种色谱方法有一定的线性范围，超过这一范围不对称峰则会出现。 要看是由于什么原因造成的： 分析物本身的性质：这类问题首先要选择合适的色谱柱，另样品的前处理非常重要，部分样品在分析过程中分解，那肯定是拖尾的。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。 使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。 发展历史： 1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。 1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。 1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信
效液相色谱仪使用中常见故障及 解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK 管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，
则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查； (2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3-5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就
高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
液相的常见问题: 一、在实际工作中,我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移(或上下波动)的原因,可能有以下几种: 1、柱子的平衡时间长。一般来说,新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡就是时间长。当然,柱子的平衡就是时间也与它使用的流动相有关系。如果使用了离子对试剂,那么比普通的简单的流动相(例如二元流动相:甲醇:水,乙腈:水,,,,,,) 2、系统存在漏点。如果系统存在漏点,那么出现基线向下漂移。需要检漏 3、PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移与波动。如果怀疑就是PUPM头有气泡导致基线不稳,只需要瞧仪器的压力就是否稳定就好。 4、流动相脱气。如果流动相没有脱气,基线肯定就是不稳的 5、柱后气泡。在柱子后有气泡产生,导致检测器中的读数有波动。 6、PUMP密封不好。密封不好,也会导致PUMP头的气泡(好象不可能)与漏夜,基线当然不稳定了。 7、系统的环境。仪器的使用,如温度的变化,流速的变化,,,,,,,以及梯度洗脱,当然基线漂移 8、单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞与污染,能造成流量不准确,压力波动。故也会波动,漂移 9、检测器污染或有杂质 10、如果就是紫外或二极管阵列检测器(PDA),排除以上原因还出现基线噪音大,就有可能就是氘灯的能量不足了 二、主峰后面有很多杂质峰可能原因 1,仪器问题:最有可能的就就是系统污染,尤其就是管路,比如,入口单向阀或各接口处等有盐残留; 2,色谱柱问题:这个好办,换新的色谱柱,大部分能解决问题; 3,试剂试药问题:所用试剂、试药达不到色谱级别所需,或者不同批号不同厂家的东西都有可能影响,最直接影响的就就是物质的纯度影响流动相的吸收; 4,梯度洗脱程序:梯度洗脱程序设置不合理,比如在某个时间段急剧变化; 5,其她:如配制方法不同,超声方法不同等。 如今,瞧似很简单的问题,在经过很长一段时间的摸索后发现,上述原因其实都就
液相色谱常见问题及处理方法 HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 1、样品量不足，解决办法为增加样品量 2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 4、检测器衰减太多。调整衰减即可。 5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数 6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 7、检测池中有气泡。解决办法为排气。 8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 9、流动相流量不合适。调整流速即可。 10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 为什么HPLC柱柱压过高 柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。 1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查； 2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查； 3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查； 4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化 漂移现象 1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 快速变化现象 1. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合HPLC 仪器问题 1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？ 答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线
液相的常见问题： 一、在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下波动）的原因，可能有以下几种： 1、柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如二元流动相：甲醇：水，乙腈：水，，，，，，） 2、系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏 3、PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑是PUPM 头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。 4、流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线肯定是不稳的 5、柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动。 6、PUMP密封不好。密封不好，也会导致PUMP头的气泡（好象不可能）和漏夜，基线当然不稳定了。 7、系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化，，，，，，，以及梯度洗脱，当然基线漂移 8、单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力波动。故也会波动，漂移 9、检测器污染或有杂质 10、如果是紫外或二极管阵列检测器（PDA），排除以上原因还出现基线噪音大，就有可能是氘灯的能量不足了 二、主峰后面有很多杂质峰可能原因
1，仪器问题：最有可能的就是系统污染，尤其是管路，比如，入口单向阀或各接口处等有盐残留； 2，色谱柱问题：这个好办，换新的色谱柱，大部分能解决问题； 3，试剂试药问题：所用试剂、试药达不到色谱级别所需，或者不同批号不同厂家的东西都有可能影响，最直接影响的就是物质的纯度影响流动相的吸收；4，梯度洗脱程序：梯度洗脱程序设置不合理，比如在某个时间段急剧变化；5，其他：如配制方法不同，超声方法不同等。 如今，看似很简单的问题，在经过很长一段时间的摸索后发现，上述原因其实都是比较客观的，如果以上4点都解决不了，可以考虑以下原因：仪器本身功能上的区别导致。比如安捷伦低压梯度和高压梯度做的同样的东西，能重复出来，而且梯度峰都很小，甚至没有，而用岛津的低压和高压梯度仪器，所表现的就不一样了，具体原因，因只具有经验所得，所以目前只能作为讨论的一个话题，仅供各位参考。 三、冲洗液相管路 1、如果系统污染可以考虑用异丙醇冲洗，把过滤后的异丙醇当流动相，以0.5ml/min冲洗30-60分钟，一般杂质就可清除。如果不行可以考虑12%的磷酸冲洗，它可以有效清洗不锈钢和其它材料的管路，清除有机杂质及污垢，比用有机溶剂更有效，也比用稀硝酸有效（用5-15%硝酸清洗虽然有效，但是清洗后系统很难平衡，特别低紫外区域）。磷酸清洗方法如下：先用甲醇或者乙腈彻底清洗系统，然后是纯水，然后是12%磷酸冲洗60分钟左右，冲洗过程中可以将进样器一并冲洗，然后换用水，甲醇或乙腈冲洗，这样就基本可以了。 2、用5%硝酸洗脱管路1h后未知峰去无踪，效果不错，推荐大家有必要试
高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法 ●高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 ●常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI（针对Waters高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高， 1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查； (2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。问题无法解决可考虑更换色谱柱。 2、流速设定不正确：可重新设定正确流量。 3、流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。 4、系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因： 1、柱温波动。解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。 2、流通池被污染或有气体。解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。 3、紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯 4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。 5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。 6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处
高效液相色谱常见故障的判定及解决方法总汇 压力异常 操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。 A、没有压力显示，没有流动相流动 原因解决方法 1、电源问题1、接通电源，开机 2、保险丝被烧坏2、更换保险丝 3、控制器设定不正确或设定失败3、a、采取恰当的设定b、修理或更换控制器 4、柱塞杆折断4、更换柱塞杆 5、泵头内有空气5、溶剂脱气、启动泵抽出空气 6、流动相不足6、a、补充流动相b、更换入口滤头 7、单向阀损坏7、更换单向阀 8、漏液8、拧紧或更换手紧接头 B、流动相流动正常，但没有压力显示 原因解决方法 1、仪表损坏1、更换仪表 2、压力传感器损坏2、更换压力传感器 C、压力持续偏高 原因解决方法 1、流速设定过高1、调整流速设定 2、柱前筛板堵塞2、a、在允许情况下反冲色谱柱b、更换筛板c、更换色谱柱 3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀3、a、使用恰当的流动相b、冲洗色谱柱 4、色谱柱选择不当4、选择恰当的色谱柱 5、进样阀损坏5、清洗或更换进样阀 6、柱温过低6、提高温度 7、控制器失常7、修理或更换控制器 8、保护柱阻塞8、清洗或更换保护柱 9、在线过滤器阻塞9、清洗或更换在线过滤器 D、压力持续偏低 原因解决方法 1、流速设定过低1、调整流速 2、系统漏液2、确定漏液位置并维修 3、色谱柱选择不当3、选择恰当的色谱柱 4、柱温过高4、降低温度 5、控制器失常5、维修或更换控制器 E、压力不断上升 原因解决方法 1、见列表C 1、见列表C F、压力降为零 原因解决方法 1、见列表A、B 1、见列表A、B G、压力不断下降，但不回零
四、高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（图3-1-2）。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图 1.高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 (1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 (2) 高压输液泵。高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
图3-1-3 恒流柱塞泵 (3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。 2.进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。六通进样阀是最理想的进样器，其结构如图3-1-4。 图3-1-4 六通进样阀装置 3.分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，如图3-1-5。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。 图3-1-5 常见色谱柱外形
异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰, 轻微的拖尾是正常的, 这是由分离系统所决定的。在此仅对几种异常峰进行分析。 1.峰前或峰后有小峰的分析 产生原因大致分为以下几种情形 (1) 样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱,对样品进行分离比较, 选择合适的分离条件。 (2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。 (3) 色谱柱柱容量下降。当长时间使用后, 有一些强保留组分吸附在柱子中, 不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱, 或更换色谱柱可使问题得到改善。 (4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时, 有时即使进样体积很小, 也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。
(5) 流动相不恰当。此情况较罕见, 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡, 而出双峰, 这种双峰是无法分离完全的, 改变色谱条件尤其是p H 值会使峰形正常。 (6) 样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。 2.负峰分析 在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰, 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的, 可针对不同情况进行排除, 进而使问题得到解决。 (1) 流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。 (2) 进样过程中进入空气。进行排气处理, 直到基线平稳再进样。 (3) 样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。 (4) 配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品, 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。 3.前沿、拖尾峰分析 拖尾：1 干扰峰，优化条件分离；2 色谱柱塌陷，更换色谱柱；3 流动相pH不合适，调节pH值；4 管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下。
高效液相色谱使用常见问题 症状： (一)保留时间变化 可能的原因: 解决方法 1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡: 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够: 用>25mmol/L的缓冲液 4.柱污染: 每天冲洗柱 5.柱内条件变化: 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命: 采用保护柱 (二)保留时间缩短 可能的原因: 解决方法 1.流速增加: 检查泵,重新设定流速 2.样品超载: 降低样品量 3.键合相流失: 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 4.流动相组成变化: 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加: 柱恒温 (三)保留时间延长 可能的原因 : 解决方法 1.流速下降: 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化: 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失: 同前(二)3 4.流动相组成变化: 同前(二)4 5.温度降低: 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉 可能的原因 : 解决方法 1.样品体积过大: 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强: 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道: 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效: 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏: 更换进样器转子 (五)鬼峰 可能的原因 : 解决方法 1.进样阀残余峰: 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物: 处理样品 3.柱未平衡: 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 (六)基线噪声 可能的原因 : 解决方法 1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声: 更换氘灯
高效液相色谱法常见故障排除 所长办公室文毅 日前，本人参加了高效液相色谱维修、维护及常见故障排除的培训班，现将培训内容总结如下，希望对大家的实际工作有所帮助！ 一、检测器常见故障排除 1、基线噪声 ·检测池窗口污染：用强溶剂冲洗检测池；卸下检测池，拆开清洗或更换池窗石英片。 ·样品池中有气泡：突然加大流量赶出气泡；在检测池出口端加一反压（0.2-0.3MPa）连一个0.3mm×1～2m的不锈钢管，以增大池内压（增加压力不要过大，防止检测池石英片碎裂）。 ·检测器或数据采集系统接地不良：拆去原来的接地线，重新连接。 ·检测器光源故障：检查氘灯或钨灯设定状态；检查灯使用时间、灯能量、开启次数；更换氘灯或钨灯。 ·液体泄露：拧紧或更换连接件。 ·很小的气泡通过检测池：流动相要仔细脱气；加大检测池的背压；系统检漏；有微粒通过检测池，清洗检测池；检查色谱柱出口筛板。 2、基线漂移 ·检测池窗口污染：同基线噪声描述。 ·色谱柱污染或固定相流失：更换色谱柱或使用保护柱。 ·检测器温度变化：系统恒温。 ·光源故障：更换氘灯或钨灯。 ·原先的流动相没有完全除去。 ·溶剂储液瓶污染：清洗溶剂瓶，用新流动相平衡系统。 ·强吸附组分从色谱柱中洗脱：在下一次分离之前用强洗脱能力的溶剂冲洗色谱柱；使用溶剂梯度。 3、工作站上出现大的尖峰 ·检测池内有气泡通过：溶剂脱气并彻底冲洗系统；检查连接系统是否漏液。 ·记录仪或检测器接地不良：消除噪声来源；确保良好接地。 ·样品溶解不彻底。 4、负峰 ·检测器输出信号的极性相反。
·样品的吸收小于流动相，流动相不纯。 ·样品溶剂干扰。 ·示差折光检测器中样品的折射率较低。 ·进样中带入气泡。 5、鬼峰或假峰 ·进样阀或注射器污染 ·样品溶剂与流动相不同 ·样品中有空气 ·流动相中杂质引起 ·在线过滤器或过滤沉子污染 ·溶剂储液瓶污染 6、工作站不回零 ⑴记录仪或工作站信号阶梯式上升 ·检测器的输出范围设定不当：重新设定检测器的输出范围。 ·记录仪或检测器接地不良：确保良好接地。 ·吸收过大，平头峰 ⑵记录仪、积分仪或色谱工作站在零点不平衡 ·工作站故障。 ·样品池中有空气：增大流量冲洗色谱系统除去气泡；在检测器出口处加一个背压；流动相脱气。 ·从样品池出来的光能量严重减弱：检查光路，清除堵塞物；清洗检测池或更换池窗。 ·光源故障：更换氘灯或钨灯。 ·检测器与色谱工作站之间的电路接触不良。 ·色谱柱固定相流失严重：更换色谱柱。 ·原先的流动相污染：彻底冲洗系统流动相 ·吸收太强：改变检测波长。 7、随泵运动出现噪声 ⑴基线随着泵的往复出现噪音：仪器处于强空气中或流动相脉动改变 仪器放置位置：放在合适的环境中。 ·用一调节阀或阻尼器以减少泵的脉动。 ⑵随着泵的往复出现尖刺 ·检测池中有气泡。 ·卸下检测池的入口管与色谱柱的接头，用注射器将甲醇从出口管端推进，
1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？关于漂移问题： ①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 ②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 ③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题 ①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 ②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 ③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ ①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 ②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 ③可能柱超载，减少进样量。 3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 ①样品量不足，解决办法为增加样品量 ②样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 ③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 ④检测器衰减太多。调整衰减即可。 ⑤检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 ⑦检测池中有气泡。解决办法为排气。 ⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 ⑨流动相流量不合适。调整流速即可。 ⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？ ①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； ②比例阀失效，更换比例阀即可； ③泵密封垫损坏，更换密封垫即可； ④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； ⑤系统检漏，找出漏点，密封即可； ⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。 5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？ 这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。
高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对 于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI（针对Waters高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高， 1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 2、(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查； 3、(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查； 4、(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。问题无法解决可考虑更换色谱柱。 5、流速设定不正确：可重新设定正确流量。 6、流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。 7、系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。 8、阻尼器堵塞：拆下后进行超声波清洗或更换新的阻尼器。
高效液相色谱仪简介 系统组成、工作原理 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 高效液相色谱 （high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。 使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。 发展历史
高效液相色谱常见问题分析与对策 液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。 A、峰拖尾 原因 解决方法 1、筛板阻塞 a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱 2、色谱柱塌陷 填充色谱柱 3、干扰峰 a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱 4、流动相PH选择错误 调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰 5、样品与填料表面的溶化点发生反应 a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、更改色谱柱 B、峰前延 原因 解决方法 1、柱温低 升高柱温 2、样品溶剂选择不恰当 使用流动相作为样品溶剂 3、样品过载 降低样品含量 4、色谱柱损坏 见A1、A2 C、峰分叉 原因 解决方法 1、保护柱或分析柱污染 取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。 2、样品溶剂不溶于流动相 改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。 D、峰变形 原因 解决方法 1、样品过载 减少样品载量 E、早出的峰变形 原因
1、样品溶剂选择不恰当 a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂 F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 原因 解决方法 1、柱外效应 a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池 G、K’增加时，脱尾更严重 原因 解决方法 1、二级保留效应，反相模式 a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子 2、二级保留效应，正相模式 a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法 3、二级保留效应，离子对 加入三乙胺（或碱性样品） H、酸性或碱性化合物的峰拖尾 原因 解决方法 1、缓冲不合适 a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液 I、额外的峰 原因 解决方法 1、样品中有其他组份 正常 2、前一次进样的洗脱峰 a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速 3、空位或鬼峰 a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积 J、保留时间波动 原因 解决方法 1、温控不当 调好柱温 2、流动相组分变化 防止变化（蒸发、反应等） 3、色谱柱没有平衡 在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 K、保留时间不断变化