植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华(西北农业大学 陕西杨陵 712100)提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。
关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。
但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。
采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。
关3国家自然科学基金资助,项目编号39770522。
优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。
3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。
根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。
播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。
提倡机械以精量半精量播种。
3.4 灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。
因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。
中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。
这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。
3.5 地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。
陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。
优质专用小麦可以采用地膜栽培,但不应忽视地膜覆盖后对小麦生育期及农艺性状的影响,比如植株增高,应采取化控措施,在小麦返青～起身期,喷施壮丰安防止倒伏;再如部分病虫害发生的提前与危害加重问题,应及时开展病虫防治,减少对产量和品质的影响。
同时提供麦收前一个月揭膜,减少地膜污染。
3.6 病虫害防治优质专用小麦病虫害的防治,应尽量减少化学药品残苗,不要影响食用品质。
应坚持综合防治的原则,要采用农业防治、物理防治和生物防治措施,减少化学药剂防治次数;选用高效低毒低残留农药;收获前20d以内严禁施药;使用农药增效剂,提高防治效果。
3.7 收获收获是优质专用小麦栽培的最后一个环节;也是比较关键的环节。
要做到单收、单贮、单独销售,实现优质优价优加工。
于植物遗传转化方法的研究报道颇多,不同转化方法的转化率差异较大,同一转化方法在不同植物上的转化率亦有明显差异;此外,不同学者在对转化植株进行鉴定的策略和方法上所采用的选择标记基因、报告基因,以及外源基因在受体植物上的不同表达水平所采用的鉴定方法亦有差异。
因此,本文试图通过对植物遗传转化方法及转化植株鉴定策略与方法的综合分析,旨在为进一步研究和应用高效遗传转化体系,提高转化植株的准确性,研究植物基因与表达的关系提供参考。
1 植物遗传转化方法选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转化率的重要环节之一。
尽管转基因的方法很多,但从遗传转化系统来说,可分为两大类,一类是以载体为媒介的遗传转化,另一类是外源目的DNA的直接转化。
1.1 载体法1.1.1 农杆菌T i或R i质粒介导法 农杆菌T i或R i质粒介导法是迄今植物基因工程应用最多、最理想的方法。
早在70年代末80年代初,人们发现根癌农杆菌(A robacterium tum e2 f acians)侵染植物后将其T i质粒(tum o r in2 ducing p las m id)上一段DNA(T-DNA)插入到被侵染细胞的基因组中,并能稳定地遗传给后代[1]。
此后发现T i质粒上有若干重大区域:复制起始位点,致病区(V ir区),T-DAN区和农杆碱分解代谢区。
V ir区受到植物细胞释放的信号分子的刺激才能表达,这些信号分子都是水溶性的酚类化合物。
此外,根癌农杆菌染色体致病区(chv regi on)有两个独立的转录单位, chvA和chvB,其中chvB的产物可能与根癌农杆菌表面2-环-B-葡聚糖的合成有关,是保证根癌农杆菌吸附于植物细胞壁所必需的成份,chvA可能与吸附过程有关。
而T-DNA区只要两端序列存在且方向正确,在两端序列中间插入任何一段DNA片段都可能被转移到植物基因组中。
发根农杆菌(A g robacterium rh iz o2 g enes)侵染植物是将其质粒(p las m id)上的T-DNA插入到宿主植物基因组中,这一点与T i质粒相类似。
转移机制也类似,所不同的是vir区和T-DNA区所含基因及其同源性不同[2]。
发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上,virA的产物是一种跨膜蛋白,进一步激活virG的产物。
T-DNA区的T L区具有较高的稳定性,T R区具有与生长表合成有关的基因tm s1和tm s2及农杆碱或甘露碱合成基因。
T R区可进行改造,这样R i通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核,进而使T-DNA整合到植物基因组中。
基于以上原理,生物技术工作者,先将目的基因分离和鉴定,然后构建植物表达载体,最终将目的基因插入T-DNA区,通过农杆菌T i或R i质粒介导,将外源目的基因导入植物细胞,以获得转基因植株。
这种方法目前在油菜[3]、大豆[4]、甘蓝[5]、黄瓜[6]、籼稻[7]等植物中获得成功。
现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法,简要介绍如下。
1.1.2 叶盘法 叶盘法[8]是双子叶植物较为常用也较为简单有效的方法。
选取健康的无菌苗,用打孔器打出叶圆盘,将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养,农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的T i 或R i质粒进入植物细胞,使外源目的基因整合到植物基因组中。
1.1.3 真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中,经真空处理,造伤,使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌的介导下,发生遗传转化。
这种方法在拟南芥[9]、大白菜、油菜[10、11]等均有成功地报道。
它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法,具有良好的研究与应用前景。
1.1.4 原生质体法 原生质体法[12]是指在原生质培养的早期,将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养,农杆菌的T i或R i就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内,T-DNA就可能整合在受体基因组上。
现在,农杆菌介导的植物遗传方法已广泛用于植物细胞[8]、愈伤组织、茎切段[12],子叶下胚轴[13]等遗传转化上。
1.1.5 脂质体法 脂质体是人工拟造的类脂(或胆固醇)与磷脂构成的小体,能够跨膜转运,可将核酸包裹起来,免于核酸酶的作用而保持核酸的完整性。
脂质体制备方法简单,比较稳定,毒性小。
用于研究细胞膜的相互作用和转移DNA、RNA和蛋白质等大分子到细胞中[14]。
此方法介导基因转移在烟草、青菜等植物[15]上有报道。
1.1.6 原生质球法 原生质球法与脂质体法相类似。
原生质球是除去细胞壁的细菌细胞。
通过与植物原生质体融合与吞噬作用将外源基因导入植物细胞中。
此外,作为载体法,新的转基因方法[16]有:基于A C D S转座系统建立的转化载体;利用噬菌体P1C re-lox位点的特异性重组系统;利用酵母线粒体I-Sce I核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统;利用双元细菌人造染色体载体系统等,能够提高转化率或转基因位点质量。
1.2 外源DNA直接转化法目的基因分离鉴定以后,在它的5’端加上启动子,在3’端加上终止子,目的基因就能够在植物中有效地表达。
植物基因工程中常采用的启动子是从Ca M V中分离的35S启动子,其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的no s启动子和ocs启动子。
终止子常采用no s终止子或R u2 b isco小亚基基因的3’端区域。
这样,通过修饰之后的目的基因就可以直接导入植物的外植体。
常见的外源DNA直接转化法有基因枪法、化学药剂诱导法和花粉管通道法。
1.2.1 基因枪法 基因枪(p article gun)[17]是1987年美国康奈尔大学Sanfo rd等人首先发明的。
这种方法原理简单,用被放电而加速的金属颗粒对细胞击孔,通过金属微粒将附着其表面的外源目的基因引入到受体细胞中,整合到基因组中。
在籼稻[18]、小麦、玉米[19]、谷子[20]、水稻[21]等禾谷类作物上已有许多成功地报道。
1.2.2 化学药剂诱导法 常用的转化细胞的化学药剂有聚乙二醇(PEG),多聚鸟氨酸(PLO),聚乙烯醇(PVA)等,其中以PEG应用较多,效果较好。
它们能够诱导质粒DNA进入植物细胞,从而达到转基因的目的。
应用这种方法已在大麦[22]等禾谷类作物上成功地获得了转基因植株。
1.2.3 花粉通道法 这种方法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因的转化。
它是一种直接、简便的转基因方法[23],不需要组织培养的继代,从而排除了植株再生的障碍。
最为成功和有影响的就是转基因抗虫棉的获得[24],在蔬菜作物[25]中也有应用报道。
此外,其它遗传转化方法,如显微注射法[14]、激光微束穿刺法[26],多聚阳离子基因导入法[27]等,亦在不同植物上有成功的报道。
限于篇幅,这里不再一一赘述。
迄今为止,植物基因转移方法可大致归为以上两大类。
DNA直接转化法的优点,没有宿主的限制,但转化的DNA重组率高,往往导致多拷贝整合,引起基因丢失或沉默;载体介导法,得到单拷贝或低拷贝整合的外源DNA,但易受宿主限制。
无论是载体法还是外源DNA 直接导入法,使用时可根据不同植物,不同受体等多种因素选择最佳方法。
2 转化植株的鉴定植物外植体经过农杆菌等介导或DNA的直接转化后,大部分转化体包括细胞、组织、器官或植株是没有转化的,只有少数被转化,这就需要采用特定的方法将未转化的细胞、组织、器官或植株与转化的区分开来,淘汰未转化的。
目前,应用于转基因植株的鉴定方法可分为利用标记基因进行鉴定、分子检测和免疫技术三大类,现简要分述如下。
2.1 标记基因的使用标记基因,包括选择标记基因和报告基因。
它常常用于植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织、器官和再生植株,通常与目的基因构建在同一植物表达载体上,一起转入受体。
