第六章 微生物的生长及其控制
第一节 测定生长繁殖的方法
一， 测生长量，方法如下：
（一）直接法 有粗放的测体积法和精确的称干重法。微生物的干重一般为湿重的10％—20％。
（二）间接法 1. 比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选450nm—650nm。 2. 生理指示法：如测含氮量法（一般细菌含氮量为干重的12.5％，酵母菌为7.5％,霉菌为6.5％，含氮量乘以6.25即为粗蛋白含量）
二， 计繁殖数
（一）， 直接法：指用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。但得到的数目是包括死细胞在内的总菌数，可用特色的染料作活菌染色，再用光显微镜计数。
（二）间接法：是一种活菌计数法，一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上形成菌落的原理而设计的。
1. 平板菌落计数法：可用浇注平板或涂布平板等方法。
2.厌氧菌的菌落计数法：一般用亨盖特滚管培养法。
第二节 微生物的生长规律
一， 微生物的个体生长和同步生长
同步培养：设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各个阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。
同步生长：通过同步培养的手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态。
获得微生物同步生长的方法主要有两类：（1）环境条件诱导法——用氯霉素抑制细菌蛋白质合成；细菌芽孢诱导发芽；藻类细胞的光照，黑暗控制；用EDTA或离子载体处理酵母菌；以及短期热休克法等。（2）机械筛选法——利用处于同一生长阶段细胞的体积，大小的相同性，用过滤法，密度梯度离心法或膜洗脱法收集同步生长的细胞。
二， 单细胞微生物的典型生长曲线
生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。微生物生长曲线即使一条由延滞期，指数期，稳定期和衰亡期组成的曲线。
（一）延滞期：又称停滞期，调整期或适应期。特点：（1）生长速率常数为零（2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状（3）细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性（4）合成代谢十分活跃（5）对外界不良条件反应敏感。
影响延滞期长短的因素主要有3种：
（1）接种龄：指接种物或种子的生长年龄，即它生长到生长曲线上那一阶段时用来作种子的。以指数期作种子，子代培养延滞期短，以延滞期和衰亡期作种子，子代培养物延滞期长，稳定期作种子的，子代培养物延滞期适中。
（2）接种量：接种量大延滞期短，反之长。
（3）培养基成分：接种道丰富的天然培养
基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。
出现延滞期的原因是：接种道新鲜培养液的种子细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物。故需要一段适应的时间。
（二）指数期：又称对数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。特点是：（1）生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需要的时间——代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短（2）细胞进行平衡生长（3）酶系活跃，代谢旺盛
1. 指数期中，有3个重要参数计算：
（1）繁殖代数（n）：x2+x1*2n（n次方）或n=3.322（lgx2-lgx1）
（2）生长速率常数（R）：R=3.322（lgx2-lgx1）/t2-t1
（3）代时（G）：G=t2-t1/3.322（lgx2-lgx1）
2. 影响指数期微生物代时长短的因素有（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度
3.生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（三）稳定期：又称恒定期或最高生长期。特点是：生长速率常数R等于零，处在新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等。
1. 生长产量常数Y（生长得率）可表示菌体产量与营养物的消耗关系：y=x-x0/c0-c=x-x0/c0（x为稳定期的细胞干重g/mL，x0为刚接种时的细胞干重，c0为限制性营养物的最初浓度g/mL，c为稳定期时限制性营养物的浓度）
2. 稳定期的原因有：（1）营养物尤其是生长因子的耗尽（2）营养物的比例失调（3）酸，醇，毒素或H2O2等有害代谢产物的累积（4）PH，氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜。
（四）衰亡期：微生物个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态，此时细胞形态多形化如有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶。
衰亡期的原因有：外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三， 微生物的连续培养
连续培养：又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养或密闭培养而言的。
1.连续培养的类型：（1）按控制方式分<1>恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。<2>恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于某最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
（2）按培养器级数分：单级连续培养器和多级连续培养器两类。
2.连续培养用于生产实践称为连续发酵。连续发酵与单批发酵相比优点是：（1）高效（2）自
控（3）产品质量较稳定（4）节约了大量动力。缺点是：（1）菌种易退化（2）易污染杂菌。
四， 微生物的高密度培养：又称高密度发酵，一般指微生物在液体培养液中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。
进行高密度培养的具体方法有：（1）选取最佳培养基成分和各成分含量（2）补料（3）提高溶解氧的浓度（4）防止有害代谢产物的生成
第三节 影响微生物生长的主要因素
一，温度
1.生长温度3基点：最低生长温度，最适生长温度和最高生长温度。最适生长温度：简称最适温度，涵义为某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。
二， 氧气
按照微生物与氧的关系，可把它们粗分成好氧微生物和厌氧微生物。
1.好氧微生物有：（1）专性好氧菌：较高浓度分子氧的条件下才能生长，以分子氧作为最终氢受体（2）兼性厌氧菌：以在有氧条件下的生长为主，也可兼在厌氧条件下生长的微生物（3）微好氧菌
2.厌氧微生物有：（1）耐氧菌：有一般厌氧菌和严格厌氧菌之分。特点是：<1>分子氧对它们有毒，短期接触可致死<2>在空气或含10％CO2的空气中，它们固体或半固体培养基表面不能生长。<3>生命活动所需能量是通过发酵，无氧呼吸，循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供<4>细胞内缺乏SOD（超氧化物歧化酶）和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。
3. 超氧化物歧化酶学说：凡严格厌氧菌就无SOD活力，一般也无过氧化氢酶活力，所有具细胞色素系统的好氧菌都有SOD和过氧化氢酶；耐氧性厌氧菌不含细胞色素系统，但具有SOD活力而无过氧化氢酶活力。在此基础上认为，SOD的功能是保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害，从而提出了缺乏SOD的微生物必然只能进行专性厌氧生物的学说。
4.自由基：凡由均裂产生，可单独存在，具有一个或几个不配对电子的分子或原子。
三， pH
PH值表示某水溶液中氢离子浓度的负对数值。不同微生物的生长pH也存在最低，最适与最高3个数值。例如：黑曲霉在ph+2.0—2.5时，有利于合成柠檬酸，在ph=2.5-6.5，就以菌体生长为主，在ph=7左右，则大量合成草酸等。微生物培养过程中ph值得变化往往对该微生物本身及发酵生产均有不利的影响，故此需要及时调整ph。有“治标”和“治本”两种措施，表见P166。
第四节 微生物培养法概论
一个良好的微生物培养装置的基本条件：按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均质营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件，此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染。
微生
物培养技术发展的轨迹特点有：（1）从少量培养道大规模培养（2）从浅层培养发展到厚层培养（3）从以固体培养技术为主到以液体培养技术为主（4）从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养（5）从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养（6）从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化细胞（7）从单纯利用微生物细胞到利用动植物细胞进行大规模培养（8）从利用野生型菌种发展到利用变异株直至遗传工程菌株（9）从单菌发酵发展到混菌发酵（10）从低密度培养发展到高密度培养。（11）从人工控制的发酵罐到多传感器，计算机在线控制的自动化发酵罐等。
一， 实验室培养法
（一）固体培养法
1. 好氧菌的固体培养：主要用试管斜面，培养皿琼脂平板及较大型的克氏扁甁，茄子甁等进行平板培养。
2. 厌氧菌的固体培养：在厌氧菌培养基中，除保证提供6种营养要素外，还得加入适量的还原剂，必要时，还要加入刃天青等氧化还原势指示剂。具体培养方法有：（1）高层琼脂柱（2）厌氧培养皿（3）亨盖特滚管技术（重点，详见p168）用严格厌氧方法配制，分装，灭菌后的厌氧菌培养基，称为预还原无氧灭菌培养基即“PRAS”培养基（4）厌氧罐技术：这是一种经常使用的但不是很严格的厌氧菌培养技术。（5）厌氧手套箱技术
上述的厌氧罐技术，厌氧手套箱和亨盖特滚管技术成为现代实验室中研究厌氧菌最有效的“三大件”技术。
（二）液体培养法
1. 好氧菌的液体培养：由于氧在水中溶解度较小，氧的供应始终是好氧菌生长，繁殖中的限制因子。因此解决此问题，必须设法增加培养液与氧的接触面积或提高氧的分压来提高溶氧速率具体操作有：（1）浅层液体静止培养（2）将三角瓶内培养物放在摇床上作摇甁培养（3）在深层液体底部通入加压空气（4）对培养液进行机械搅拌等
实验室中常用的好氧菌培养法有以下几类：（1）试管液体培养（2）三角瓶浅层液体培养（3）摇甁培养：又称振荡培养（4）台式发酵罐
2.厌氧菌的液体培养：厌氧罐，厌氧手套箱。
二， 生产实践中培养微生物的装置
（一）固态培养法
1.好氧菌的曲法培养
通风曲：是一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业种广泛应用。
2.厌氧菌的堆积培养法
（二）液体培养法
1.好氧菌的培养：（1）浅盘培养：这是一种用大型盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法（2）深层液体通风培养：发酵罐是一种最常规的生物反应器。
第五节 有害微生物的控制
一， 几个基本概念
（一）灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体
内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌实质上可分为杀菌和溶菌两种。
（二）消毒：就是消除毒害，这里的毒害专指传染源或致病菌。消毒是一种采用较温和的理化因素。
（三）防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品，生物制品等对象发生霉腐的措施。方法有：（1）低温（2）缺氧（3）干燥（4）高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施保存食物（5）高酸度：如泡菜工艺（6）高淳度：用白酒或黄酒保存食品（7）加防腐剂
（四）化疗：即化疗治疗，指利用具有高度选择毒性即对病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。
化学治疗剂：用于化学治疗目的的化学物质。包括磺胺类等。
二， 物理灭菌因素的代表——高温
（一）高温灭菌的种类
1. 干热灭菌法：把金属器械或洗净的玻璃皿放入电热烘箱内，在150-170摄氏度维持1-2h后，可达到彻底灭菌的目的。
2.湿热灭菌法：是指用100摄氏度以上的加压蒸汽进行灭菌。
湿热灭菌的种类有：
（1）常压法：<1>巴氏消毒法：专用于牛奶，啤酒，果酒或酱油等不宜高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。是一种低温消毒法，处理温度变化很大，一般在60-85摄氏度处理30min—15s。具体方法有：低温维持法和高温瞬时法两种。<2>煮沸消毒法：采用在100摄氏度下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。<3>间歇灭菌法：又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。
（2）加压法：<1>常规加压蒸汽灭菌法：一般称作“高压蒸汽灭菌法”<2>连续加压蒸汽灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”此法仅用于大型发酵厂的大批培养基灭菌。培养基一般加热至135—140摄氏度下维持5-15s。优点：○采用高温瞬时灭菌，灭菌彻底○总得灭菌时间比分批灭菌法明显减少，故缩短了发酵罐的占用时间，提高了它的利用率○由于蒸汽负荷均衡，故提高了锅炉的利用效率○适宜于自动化操作，降低了操纵人员的劳动强度。
利用温度杀菌的定量指标有两种（1）热死时间：指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间（2）热死温度：又称热死点，指在一定时间内，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。
（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素
1.灭菌物体含菌量2.灭菌锅内空气排除程度3.灭菌对象的ph4.灭菌对象的体积5.加热与散热速度
（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止
1. 有害影响：形成沉淀物；破坏营养，提高色
泽；改变培养基的ph，降低培养基浓度。
2.防止法：（1）采用特殊加热灭菌法：将培养基成分分开分别灭菌后，再合并。（2）过滤除菌法等。
三， 化学杀菌剂，消毒剂和治疗剂
最低抑制剂（MIC）：是评定某化学药物药效强弱的指标，在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。
半致死剂量（LD50）：是评定某药物毒性强弱的指标，指在一定条件下，某化学药剂能杀死50％试验动物时的剂量。
最低致死剂量（MLD）：是评定某药物毒性强弱的另一指标，指在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100％死亡率的最低剂量。
（一）表面消毒剂：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。石碳酸系数：指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石碳酸的最高稀释度之比。
（二）抗代谢药物的代表——磺胺类药物
抗代谢药物：又称代谢拮抗物或代谢类似物，是指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。
抗代谢药物主要有3种作用：（1）与正常代谢物一起共同竞争酶的活性中心，从而使微生物正常代谢所需的主要物质无法正常合成，如磺胺类（2）使微生物合成出无正常功能的RNA（3）某些抗代谢药物与某一生化合成途径的终产物的结构类似。
磺胺的作用机制：磺胺的结构与细菌的一种生长因子对氨基苯甲酸高度相似，故是它的代谢类似物，因此两者间会发生竞争性拮抗作用。
在THFA的合成过程中，两种抗代谢物——磺胺和三甲基苄二氨嘧啶（TMP，一种磺胺增效剂）作用机制是：磺胺会抑制2-氨-4-羟-7,8-二氢蝶啶酰焦磷酸与PABA的缩合反应。这是因为磺胺为PABA的结构类似物，两者发生竞争性拮抗作用。即二氢蝶酸合成酶会错把磺胺作底物，结果合成了无功能的“假二氢叶酸”——2-氨-4羟-7,8二氢蝶酸的类似物。因此凡能利用二氢蝶啶和PABA合成叶酸的细菌就无法合成叶酸，于是生长受到了抑制。另外，TMP因能抑制二氢叶酸还原酶，故使二氢叶酸无法还原成四氢叶酸，也就是增强了磺胺的抑制作用。
（三）抗生素
1.抗生素：是一类由微生物或其他生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。
2.种类，活力单位与制菌谱
抗生素的活力称为效价，其剂量一般用“单位”（unit）表示。测定效价方法有物理学方法，化学方法和生物方法等几种。生物效价可用稀释法，比浊法或扩散法测定，其中以扩散法中的管
碟法最为常用。
抗菌谱：各种抗生素有其不同的制菌范围。如青霉素和红霉素主要抗G+细菌，链霉素和新霉素以抗G-细菌为主等。
3.半合成抗生素与生物药物素
（对天然抗生素的结构进行人为改造后的抗生素称为半合成抗生素。把具多种生理活性的微生物次生代谢物称作生物药物素。
4.微生物的抗药性
产生抗药性原因有：（1）产生一种能使药物失去活性的酶（2）把药物作用的靶位加以修饰和改变（3）形成“救护途径”（4）式药物不能透过细胞膜（5）通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。