蛋白质印迹法western blot应用介绍

影响抗原抗体反应的因素
电解质---电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因 此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。
酸碱度---抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般 为pH6.0-8.0。
温 度---温度升高可使反应加速，但温度高于56℃时 ，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。
胶不平？ 对
凝胶漏液？ 策
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
背景太高
原因
➢ 抗体浓度过高 ➢ 封闭不充分
➢ 膜没有均匀浸湿 对 ➢ 膜或者缓冲液污染 策
➢ 抗体与封闭剂出现 交叉反应
Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗
体与抗原的结合。
一抗孵育 (Primary antibody incubation)
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一 抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗 孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗 体的说明选择适当的孵育温度和时间。
蛋白检测 (Detection of proteins)
DAB显色 法
化学发光显色法(ECL )
ECL显色原理：(二抗用HRP 标记)反应物为过氧化物+鲁米诺， 如果遇到HRP即发光，可使胶片 曝光显影。
ECL化学发光显色
比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点
DAB显色
比较灵敏，是HRP最敏感的底物
NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的荧 光二抗， 37 ℃缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一抗进 行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗 小鼠IgG的二抗。
回收二抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟 。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间 并增加洗涤次数。
解液200μl于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶
使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。
D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml
EP管中，再用超声破碎仪破碎细胞后，4℃下12000rpm离
心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。
（2）．蛋白含量测定（福林-酚法 ）
✓ 确保灌胶均匀
条带模糊
原因
➢ 蛋白样品部分变性
✓ 完全变性蛋白 ✓ 确保加入足够的DTT或
➢ 蛋白样品部分还原 对
β-巯基乙醇
策
➢ 电泳时间过长
✓ 观察指示剂染料，掌握
恰当的电泳时间
哑铃型条带或 “微笑” 条带
原因
➢ 上样体积过大导致不完
全堆积
对
➢ 电泳过程中电场不均匀 策
➢ 分离胶表面不齐
✓ 使用恰当上样体积 ✓ 如果蛋白浓度已知，
交叉反应
✓ 杂交前检测一抗、二抗 的工作浓度
✓ 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿
✓ 拿取膜与吸水纸时要戴 手套，更换新鲜转膜缓 冲液
✓ 检测一抗、二抗与封闭 剂是否有交叉反应
蛋白带型条状
原因
➢ 上样过量 ➢ 样品沉淀 ➢ 样品中的污染 ➢ 制胶不佳
✓ 降低上样量
对 ✓ 加大样品中的SDS浓度 策 ✓ 离心样品
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶（分离胶）
静置1h后制上层胶（浓缩胶） 2、配制上层胶（浓缩胶）
加完后插上梳子，静置1h
上样时确保对称 ✓ 制胶时使分离胶表面
水平
无条带的原因
➢ 蛋白样品制备 ➢ 检查胶：考马斯亮蓝染胶 ➢ 检查膜：丽春红S染色 ➢ 抗体滴度太低 ➢ 显色 ➢ 试剂放置太久或存放条件不正确
谢谢！
目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马 斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、 BCA法等。
1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、 300 μg/mL（用PBS配制）。
样品液：取原液2 μL至200 μL （用PBS配制）。 2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值 ，取溶液/样品40μL和E液40μL，每个浓度点均作三复孔，振 荡混匀。37°C反应10 min后，加入福林酚试剂（1:15稀释） 160μL，振荡混匀，37°C反应30 min。630 nm下测光密度 值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样 品蛋白浓度。
回收一抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤510分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗 涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤 次数。 注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选 用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。
二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)
。
转膜后检测（此步可以省略）
✓ 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸
纤维素滤膜，换水几次。
✓ 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白
探针的Western印迹过程。
封闭(Blocking)
将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白 质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白 质结合。 ➢ 封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml） 牛血清白蛋白溶液( BSA ) ➢ 摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4℃过夜。
槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 － |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|＋
转膜条件： 推荐：100V ，1—2小时；根据蛋白大小以及胶厚度 的不同而不同。
转膜注意事项
➢ 滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 ➢ 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 ➢ 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 ➢ PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润
蛋白质印迹法 （western blot技术）
威斯腾生物技术中心 2014.9.1
Western Blot介绍 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot 介绍
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年 所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称 为Western Blot。
(Protein sample preparation)
（1）贴壁细胞蛋白样品收集
分多次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收
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集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心
管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂
制胶
制胶过程注意事项：
➢操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 ➢加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被 冲变型。 ➢灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 ➢分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织 总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特 异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用 于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等 多个方面。
Western Blot流程
收集蛋白样品
(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
✓ 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
✓ 延长封闭时间或更换封闭 液
✓ 转膜前用甲醇将膜完全浸 湿
✓ 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液
✓ 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应
非特异条带多
原因
➢ 抗体浓度过高
➢ 膜没有均匀浸湿
➢ 膜或者缓冲液污染 对
➢ 封闭不充分
策
➢ 抗体与封闭剂出现