第九章 维生素类药物的分析 - 浙江大学

=6.815 A325 –2.555A310-4.260A334 6.讨论 1）.吸收度校正方法： 维生素A醋酸酯：直线方程法（代数法） 维生素A醇：相似三角形法（几何法或6/7定位 法） 2）.在应用三点校正法时，除其中一点是在最大
吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰 的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时， 会产生较大误差。因此，在测定之前务必要校 正波长，并可用全反式维生素A进行测定，比 较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进 一步核对波长是否准确。测定的样品不得少于 两份。 7.应用示例 维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维 生素AD滴剂等均可采用本法测定。
1.三点校正法的建立 V.A在325nm-328nm的波长范围内具有最 大吸收，可用于含量的测定。但其中有 很多杂质在紫外区也有吸收，而干扰V.A 的准确的含量测定。其中有其多种异构 体、氧化降解产物、合成中间体和副产 物等。采用“三点校正法”能够消除这 些杂质的无关吸收的干扰。
什么是“三点校正法” ？
• 4.讨论 1) 对吸收特性不同的物质采用不同的波长和灵 敏度。 2) 虽用维生素A醋酸酯做内标测定维生素E的含 量，尽管两者的化学性质相差很大，但因其 测定波长和灵敏度的不同，结果还是较满意 的。 3) 样品处理方法简便、结果准确，样品经液-液 萃取就可以进样，省去了氮气流条件下的蒸 发等步骤，缩短了分析时间。
• 3）换算因子： • 4）A值的选择： a.计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值 相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。 b.判断法 最大吸收波长在326-329nm之间，且5个波长下 的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用 328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。
最大吸收波长不在326-329nm之间，计算5个波 长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02， 这是应按以下的方法进行判断： 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝 对值在3.0%，则仍不用校正公式计算吸收度。 可直接用A328代入E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝 对值在-15.0%到-3.0%，则应用A328校正代入 E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝 对值在小于-15%或大于+3%，则不能用本法测 定，应使用第二法。
• 2.不稳定性 由于有多个不饱和键，所以性质不稳定，易被 空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光所裂解， 特别是在加热和金属离子存在是，更易氧化变 质，生成无生物活性的环氧化合物维生素醛或 维生素酸。维生素A对酸不稳定，遇Lewwis 或 无水氯化氢乙醇液，可发生脱水反应。其中 V.A的醋酸酯比V.A稳定。由于不稳定性，所 以应保存在凉暗处，并需充氮气或加入合适的 抗氧剂。
（三）薄层色谱法
• 第一种： BP（2000） • 吸附剂：硅胶G • 流动相：环几烷-乙 醚（80：20） • 显色剂：三氯化锑 • 第二种：USP（24） • 硅胶 • 环几烷-乙醚（80： 20） • 磷镭酸
三.含量测定
先用紫外分光光度法代替反应专属性差、 呈色不稳定的三氯化锑比色法。但由于 三氯化锑比色法操作简便、快速，所以 目前仍旧是食品或饲料中V.A含量测定的 常用方法。 （一）紫外分光光度法（三点校正法）
三点校正法是指在三个波长处测得吸收 度后，在规定的条件下以校正公式进行 校正，再进行计算。这样就可以消除无 关吸收的干扰。 注：V.A在325nm-328nm的波长范围内有 最大吸收，其最大吸收波长随溶剂的不 同而有所不同。具体数据见P209 表9-3。
2.测定原理
两点原理： • （1）.杂质的无关吸收在310nm-340nm的波长 范围内几乎成一条直线，且随波长的增大吸收 度下降。 • （2）.物质对吸收呈加和性的原理。 3.波长的选择 选择原则：一点选择在维生素A的最大吸收波长 处 ，其他两点选择在的两侧各选一点（ • 第一法（等波长差法） • 第二法（等吸收比法）
如果最大吸收波长不在326-329nm之间， 也不能用本法测定。 第一法的校正公式为： A328校正=3.52（2 A328 –A316-A340）
（2）第二法（皂化法，适用于维生素A醇）
• 1）方法 精密称取一定量的供试品，加KOH乙醇溶液后 煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、洗涤、 滤过、浓缩和干燥等处理，最后用异丙醇溶解 残渣并稀释成每1ml中含维生素A为9-15个国际 单位数的溶液，在300、310、325、334nm波长 处测定吸收度，并确定最大吸收波长（应为 325nm）。 • 2）计算 同第一法。看书上p210-211
4）排除了样品中的 干扰物质，方法专属性强。 可用停留扫描及吸收度比测定技术对样品中 retinol和a-tocopherol与已知对照品进行对照来 说明。 5）贮藏： 在制备和贮藏温度下，保存6个月未发生变化； 无水乙醇和工作用乙醇2-10摄式度条件下，可 分别稳定2周和1周。其中样品的正己烷提取液 比较稳定，可以隔夜后进行分析测定。
• 3。紫外吸收特性 在325-328处有最大吸收，可用于鉴别和 含量测定 • 4.与三氯化锑呈色 V.A在氯仿溶液中能与三氯化锑作用，产 生不稳定的蓝色。可用于鉴别或用比色 法测定含量
二. 鉴别实验
（一）三氯化锑反应 1.原理 V.A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液 中即显蓝色，渐变成紫红色。 2.机制：V.A和氯化锑（ 三价）中存在的 亲电试剂氯化高锑（五价）作用形成不 稳定的蓝色碳正离子。 3.方法 见书P207
• （3）温度对呈色强度的影响很大，样品滴定 时的温度应绘制标准曲线时的温度相差的绝对 值应在1摄式度以内。否则应重绘标准曲线。 • （4）反应并非维生素A专属，在相同情况下， 4 A 某些物质也会与三氯化锑反应生成显蓝色，常 使测定的结果偏高。 • （5）三氯化锑具有腐蚀性，所以使用时应该 当心。
3）A值的选择
如果最大吸收波长在323-327nm之间，且A300 /A325比值<=0.73，按下法判断： a. 若（A325校正-A325）*100%/A325 所得的数值的 绝对值在3%，可直接用A325 代入E=A/C.L b.若（A325校正-A325）*100%/A325 所得的数值的 绝对值超过3%，则用应用A325校正代入E=A/C.L 如果最大吸收波长不在323-327nm之间，或A300 /A325比值>0.73，表示供试品中杂质含量太高， 应采用色谱法将未皂化部分纯化精辟再进行测 定。
4.杂质的吸收 • 对V.A有影响的杂质主要有以下几种： • (1) V.A2 和V.A3 • (2)维生素A的氧化产物 • (3) 维生素A在光照下产生的无活性的聚合物 • (4)维生素A的异构体等。 以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有 吸收，干扰维生素A的测定。
5.测定方法 （1）第一法（直接测定法，适用于纯度高 的维生素A醋酸酯） • 1）方法 见书上P210 • 2）计算 a.吸光系数E1%1cm b.求效价（IU/g）： c.求维生素A醋酸酯占标示量的百分含量
第九章 维生素类药物的分析
• 维生素是维持人类机体正常代谢功能所 必需的一类活性物质，主要用于机体的 能量转移和代谢调节，体内不能自行合 成，须从事物中摄取。这类药物的分析 方法很多，有生物法、微生物法、化学 法和物理化学法，但目前常用的分析方 法是化学法或物理化学法。
第一节 维生素A的分析
• 维生素A包括有 a. 维生素A1（视黄醇）活性最强 不饱和脂肪醇 主要来源于鲛类无毒海鱼 肝脏中提取的脂肪油。在鱼肝油中维生 素A多以各种酯类混合物的形式存在，其 中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 b.维生素A2（去H 维生素）30%-40% c.维生素A3（去水维生素）0.4%
•
1) 线形关系：模拟样品提取液配比 、连续进样 3次 、 用峰高比对浓度作图 2) 维生素A的回归方程： 3) 维生素E的回归方程： 4) 检测量： 问：检测量与被检测物质及其浓 度和进样量有关吗？ 5) 回收率试验： 6) 精密度试验：用正常人的血清样品进行精密 度试验，由回归方程计算实际浓度。
一 结构和性质
（一）结构 • 维生素A的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的 环己烯，具有许多立体异构体。维生素A多为 全反式。不同的异构体具有相似的化学性质， 但具有不同的光谱特性和生物效价。 （二）性质 • 1.溶解性 由于是有机物，所以具有脂溶性，溶于乙醚、 石油醚等有机溶剂中，在乙醇中微溶，在水中 不溶。
附：三点校正法公式推导
1.公式A328校正=3.52（2 A328 –A316-A340）推 导 2.公式A325校正=6.815 A325 –2.555A3104.260A334推导
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（三）高效液相色谱法 采用RP-HPLC法同时测定人血清中维生 素A和维生素E的含量。 • 1.仪器： • 2.分析用样品液： 1) 对照品：维生素A、维生素E 、维生素 A醋酸酯 2) 血清样品制备： •
采血后立即离心，置5ml塑料试管中，充氮、 密封，于-40摄式度保存备用。 精密量取血清200微升，精密加入含一 定浓度内标溶液的无水乙醇200微升， 振荡30s，精密加入正己烷，离心，取 正己烷层100微升进样。 3.方法与结果
（二）三氯化锑比色法
• 1.原理 维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作 用，产生不稳定的蓝色，在618nm-620nm的波 长处有最大吸收，符合Beer定律。 • 2.方法 配置溶液，加入一定量的三氯化锑氯仿 溶液以后，在5-10s内，于620nm处测定吸收度， 绘制标准曲线。按同法测定供试品溶液的吸收 度，根据标准曲线计算含量。 • 3.注意事项 • （1）要求操作迅速 • （2）反应介质应无水
4.注意事项 无水无醇条件下进行及其原因：水可使三氯化 锑水解成氯化氧锑，而乙醇可以和正离子作用 使其正电荷消失。所以仪器和试剂必需干燥无 水，氯仿中应无醇。 （二）紫外吸收光谱法 1.方法 配制溶液，并立即用紫外分光光度计在 300-400nm的波长范围内进行扫描，则应在348、 367、389nm的波长处有三个尖锐的吸收峰，且 在332的波长处有较低的吸收峰或拐点。 2.讨论 最大吸收波长与共轭程度有关：共轭程 度越大，其波长也就越大。具体情况见P208