下载文档原格式
不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用朱宛宛;李宁;王芳;付琳琳;徐艳玲;关云谦;张愚【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2009(031)004【摘要】目的比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.【总页数】7页(P468-472,后插4-后插5)【作者】朱宛宛;李宁;王芳;付琳琳;徐艳玲;关云谦;张愚【作者单位】首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;首都师范大学,生命科学学院生殖与发育研究室,北京,100037;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053;首都医科大学,宣武医院,老年病研究所细胞治疗室,北京,100053;教育部神经变性病重点实验室,北京,100053【正文语种】中文【中图分类】Q254【相关文献】1.不同功能状态滋养层对人胚胎生殖嵴干细胞生长作用的实验研究 [J], 李欣;刘尧;李丽君;秦茂林;杨卫兵;李红丽2.三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较 [J], 李斌;彭秋平;卢伟英;徐雯;金应霞;黄元华3.体外人表皮细胞培养技术:不同滋养层细胞对角朊细胞生长融合的影响 [J], 汪培铭;冯光珍;孙红;卫俊霞;于大山4.人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究 [J], 刘峰;徐永胜;俞海燕;王薇;张纯5.维持人胚胎干细胞多能性顺式作用元件的筛选 [J], 孙梦瑶;刘思琪;周凡琦;马艳妮;余佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验日期：2023年11月10日实验地点：细胞生物学实验室实验者：[您的姓名]指导教师：[指导教师姓名]一、实验目的1. 学习掌握人鼠细胞共培养的基本原理和操作方法。
2. 观察人鼠细胞共培养过程中细胞的生长状态和形态变化。
3. 探讨人鼠细胞共培养在生物医学研究中的应用。
二、实验原理细胞共培养是指将不同种类的细胞在同一培养体系中共同培养，以研究细胞间的相互作用和信号传导。
人鼠细胞共培养作为一种重要的实验模型，可以模拟体内多种生理和病理过程，为研究细胞生物学、发育生物学、免疫学等领域提供有力支持。
三、实验材料1. 人胚胎成纤维细胞（HEK293T）和鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）。
2. DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素混合液。
3. 细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜、图像采集系统等。
四、实验方法1. 将HEK293T和NIH3T3细胞分别用DMEM培养基培养至对数生长期。
2. 将HEK293T和NIH3T3细胞按1:1比例混合，接种于培养皿中，放入培养箱中培养。
3. 观察细胞生长状态，记录细胞形态变化。
4. 在不同时间点，收集细胞进行染色、计数等分析。
五、实验结果与分析1. 细胞生长状态观察：在共培养过程中，HEK293T和NIH3T3细胞均能正常生长，细胞形态规则，细胞间连接紧密。
2. 细胞形态变化：在共培养早期，细胞形态无明显变化；随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变得不规则，细胞间连接减少。
3. 细胞计数：在共培养过程中，HEK293T和NIH3T3细胞的数量均呈上升趋势，但共培养组细胞数量增长速度略低于对照组。
4. 细胞染色分析：共培养组细胞在染色后，可见细胞核、细胞质等结构清晰，细胞形态与对照无明显差异。
六、讨论1. 人鼠细胞共培养是一种重要的实验模型，可以模拟体内多种生理和病理过程，为研究细胞生物学、发育生物学、免疫学等领域提供有力支持。
2. 本实验结果表明，HEK293T和NIH3T3细胞在共培养过程中能够正常生长，细胞形态无明显变化。
2024年统编版2024选修3生物下册月考试卷578考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五六总分得分评卷人得分一、选择题(共9题，共18分)1、关于桑椹胚和囊胚的比较，下列叙述正确的是A. 桑椹胚的内细胞团将来可发育成胎儿的各种组织B. 囊胚的滋养层细胞具有发育的全能性C. 囊胚期细胞分化是由于遗传物质突变引起的D. 囊胚的进一步扩大会导致透明带的破裂2、人类13号染色体上Rb基因突变是导致视网膜母细胞瘤的原因之一。
已知Rb基因表达产物pRb蛋白可与调控因子E2F结合，进而抑制E2F的功能。
E2F可与靶基因结合启动靶基因的表达，最终能促进细胞分裂，过程如图所示。
下列分析不合理的是（）A. Rb基因可能是一种与癌变有关的抑癌基因B. Rb基因突变产生的新基因是其等位基因C. E2F通过调控DNA聚合酶的合成促进细胞分裂D. 可以通过修复造血干细胞中的Rb基因治疗该病3、CD47是一种细胞膜表面糖蛋白，可与巨噬细胞结合，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用。
为验证抗CD47的单克隆抗体可以减弱CD47对巨噬细胞的抑制作用，科学家按照如下流程进行了实验，下列叙述错误的是（）A. 实验流程中CD47充当抗原的作用B. 融合、筛选得到的杂交瘤细胞不一定能产生抗CD47的单克隆抗体C. 对照组应设置为：巨噬细胞+正常细胞共培养体系+单克隆抗体D. 预期实验结果为：实验组的巨噬细胞的吞噬能力高于对照组4、中国科学院孙强团队对一流产雌性猕猴进行克隆；成功获得“中中”和“华华”两姐妹，突破了现有技术无法体细胞克隆非人灵长类动物的世界难题，为建立人类疾病的动物模型，研究疾病机理，研发诊治药物带来光明前景。
下图为“中中”和“华华”培育的流程，相关叙述正确的是（）A. 过程①将成纤维细胞注射在放射冠和透明带间，可降低对卵细胞的损伤B. 过程②在培养基中加入动物血清，可为激发成纤维细胞核的全能性提供物质条件C. 过程③进行同步发情处理，可降低代孕母猴对“中中”、“华华”的免疫排斥反应D. 与模型小鼠相比，模型猴更适合于研究人类疾病的发病机理、研发诊治药物5、“筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述错误的是（）A. 基因工程中通过标记基因筛选出的细胞不一定含重组质粒B. 在小鼠胚胎细胞培养过程中，需要通过筛选才能获得具有无限分裂能力的细胞C. 植物体细胞杂交过程中，原生质体融合后获得的细胞需要进行筛选D. 单克隆抗体制备过程中，第二次筛选出的细胞既能无限增殖又能产特定抗体6、下图为受精作用及胚胎发育示意图，a、b代表两个发育时期；下列叙述不正确的是（）A. ①过程发生了基因自由组合，增加了后代的多样性B. ②过程通过有丝分裂增殖C. a时期可分离得到胚胎干细胞D. ②→④过程，细胞分化程度逐渐增大7、在实验室内利用胚胎干细胞（ES细胞）制作小鼠胚胎模型，探究人类某些疾病的发病机制。
干细胞在医学中的应用摘要：干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。
根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。
根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。
干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
关键字：胰岛干细胞、神经组织细胞、皮肤干细胞、干细胞、脐血干细胞、成人干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞前言：干细胞即为起源细胞。
简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。
干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。
胚胎干细胞（Embryonic stem cell）的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。
据文献报导干细胞是一类具有自我更新和分化潜能并保持未分化状态的细胞。
它包括胚胎干细胞和成体干细胞。
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。
目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。
最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。
在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。
在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。
胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。
胚胎干细胞的培养体系综述摘要：综述胚胎干细胞培养基、有饲养层培养体系和无饲养层培养体系的主要成分，以及无血清胚胎干细胞培养基。
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞。
）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。
而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。
关键词：胚胎干细胞培养体系培养基1、培养基的主要组成ES细胞培养液的组成是在基础培养基上添加血清、IIF、巯基乙醇，L一谷氨酰胺等成分，并使用饲养层细胞或条件培养基(CM)。
常用的基础培养基为含高糖(4500mg／L)和谷氨酰胺的DMEM。
由于ES细胞来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，维持其生长代谢所需的营养要充足。
高糖的DMEM可以提高ES细胞的增殖速度，同时又能提供饲养层细胞生长所需的能量。
ES细胞对谷氨酰胺要求较高，它是细胞合成蛋白质与核酸所必需的，由于谷氨酰胺在溶液中易分解，所以使用前须重新加入。
』3一巯基乙醇除了对胚胎细胞的分裂增殖有促进作用外，还可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ES细胞的损害。
添加的血清为胎牛血清(FCS)和小牛血清。
血清含有丰富的营养成分，在促进ES细胞增殖方面起到很好的作用，并对ES 细胞的贴壁生长、集落形态有重大影响。
此外它可能含有一些未知的促ES细胞分化的因子，也可能含有微量的血红蛋白和内毒素，会干扰ES细胞的生长。
但高浓度的血清并不利于ES 细胞生长。
不同批次的血清对促进ES细胞生长具有不同的效果。
每个ES细胞系依赖于建系时所用的血清批次，若更换血清，则应以该细胞系为供试细胞，在含有待测血清的培养基上进行传代培(8～10代)和克隆测试，测试合格的血清只适用于该细胞系，若用于其它ES细胞系,则仍可能出现不同的效果。
第一章测试1.干细胞可以分为多潜能干细胞和组织干细胞两种类型，组织干细胞根据来源又可以分为胚胎组织干细胞和成体组织干细胞。
（）A:对B:错答案:A2.多潜能干细胞可以根据其分化潜能分为Naïve态和Primed态，也就是原始态多能性和激发态多能性。
最初建立的小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞都是处于Primed状态的。
（）A:对B:错答案:B3.胚胎的发育起始于精卵结合后形成的具有全能性的受精卵，全能性胚胎经历6-7次细胞分裂后会形成着床前的囊胚，此时胚胎由滋养层细胞和内细胞团细胞组成，胚胎干细胞就是从具有多潜能性的滋养层细胞建系获得的。
（）A:错B:对答案:A4.体细胞核移植和诱导多能干细胞技术是现在最可靠的将体细胞重编程为全能性胚胎或多能性干细胞的两种方法。
（）A:对B:错答案:A5.全能性是指细胞具有发育为整个个体和支持个体发育的胚外组织的能力，只有受精卵和早期胚胎的卵裂球具备全能性；多能性是指细胞具有发育为整个个体所有细胞类型的能力。
（）A:错B:对答案:B6.最早的体细胞核移植实验是在哺乳动物中完成的。
（）A:错B:对答案:A7.通过显微操作构建的只两个雄原核的孤雄胚胎会在发育至一定阶段死亡，但含有两个雌原核的孤雌胚胎不会。
（）A:错B:对答案:A8.印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达。
（）A:对B:错答案:A9.显微操作仪的构成比较简单，主要由一台倒置显微镜和左右两个显微操作臂组成。
（）A:对B:错答案:A10.体细胞核移植的具体操作由去核和注核两步组成，一般受体是受精卵。
（）A:错B:对答案:A第二章测试1.人的胚胎干细胞形态与小鼠不同，相比而言人胚胎干细胞的克隆形态更加饱满致密。
（）A:错B:对答案:A2.虽然同样来源于植入前囊胚内细胞团，但人类和小鼠胚胎干细胞在形态、培养条件和信号通路上均有很大的差异。
（）A:错B:对答案:B3.胚胎干细胞可分为原态（naïve state）和始发态（primed state）两种类型，原态干细胞的经典代表是灵长类胚胎干细胞，而始发态干细胞的经典代表是啮齿类胚胎干细胞。
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
中国组织工程研究 第17卷 第40期 2013–10–01出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 1, 2013 Vol.17, No.40doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.012 []孙加斌，顾翔，潘月晴. 人胚胎成纤维细胞饲养层的制备[J].中国组织工程研究，2013，17(40):7096-7101.P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7096www.CRTER .org孙加斌★，男，1987年生，山东省邹城市人，汉族，扬州大学医学院在读硕士，主要从事心血管疾病基础及临床方面的研究。
********************通讯作者：顾翔，教授，主任医师，博士生导师，江苏省苏北人民医院心血管内科(扬州大学第一临床医学院)，江苏扬州市 225001sbyygx@medmail. 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)40-07096-06收稿日期：2013-03-09 修回日期：2013-04-07 (201303011/G ·W)Sun Jia-bin ★, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China ********************Corresponding author: Gu Xiang, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China******************.cnReceived: 2013-03-09 Accepted: 2013-04-07人胚胎成纤维细胞饲养层的制备*★孙加斌1，顾 翔1，潘月晴2 (江苏省苏北人民医院，1心内科，2妇产科，江苏省扬州市 225001)文章亮点：1 因为人胚胎成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞、人胚胎生殖细胞等人干细胞的生长，从而推测人胚胎成纤维细胞亦能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。
两种体系下诱导多潜能干细胞定向分化为运动神经元前体细胞的差异李哲;方明珠;陈红;郭钢花;范家宏;毛志娟【摘要】目的将人诱导多潜能干细胞(iPSCs)定向分化为脊髓运动神经元前体细胞(MNP),并比较在有无饲养层两种体系下的分化效率.方法分别在鼠胚胎成纤维细胞饲养层和无饲养层体系中培养人iPSCs.诱导6 d获得神经上皮前体细胞(NEP),诱导12 d获得MNP细胞.倒置显微镜下观察细胞形态变化,免疫荧光染色鉴定iPSCs、NEP、MNP标记物,实时定量聚合酶链反应检测NEP相关基因SOX1、HOXA3,MNP相关基因OLIG2、PAX6,及多能性基因SOX2、OCT4的转录水平.结果两种体系中iPSCs均表达多能性标记物,NEP及MNP均高表达神经相关标记物,低表达多能性标记物,有饲养层体系中NEP细胞SOX1、HOXA3,MNP细胞OLIG2、OCT4基因表达明显高于无饲养层,PAX6和SOX2表达无显著性差异.结论 iPSCs在两种培养体系均可有效分化为MNP细胞,在有饲养层体系中分化效率较高.%Objective To induce human-induced pluripotent stem cells(iPSCs)to differentiate into spinal motor neuron precursor (MNP)and compare the induction efficiency in systems of feeder and feeder-free. Methods iPSCs cultured on mouse feeder cells or in feeder-free condition were induced into neuroepithelial progenitors (NEP) on the sixth day and MNP on the twelveth day.Their morphology was observed under inverted micro-scope,and the markers of iPSCs,NEP,MNP were detected with immunofluorescence.NEP-related genes SOX1 and HOXA3,MNP-related genes OLIG2 and PAX6,and pluripotency genes SOX2 and OCT4 were detected with real-time quantitative polymerase chain reaction. ResultsiPSCs expressed pluripotency markers,while NEP and MNP expressed high levels of neural related markers and low levels of pluripotency markers in two systems. The expression of the genes SOX1, HOXA3, OLIG2 and OCT4 was higher in the feeder system,and there was no significant difference in the expression of genes SOX2 and PA X 6. Conclusion iPSCs can differentiate into MNP in culture systems of feeder and feeder-free,and the induction efficiency is higher in the feeder system.【期刊名称】《中国康复理论与实践》【年(卷),期】2018(024)003【总页数】8页(P269-276)【关键词】人诱导多潜能干细胞;运动神经元;神经分化【作者】李哲;方明珠;陈红;郭钢花;范家宏;毛志娟【作者单位】郑州大学第五附属医院,河南郑州市450052;郑州大学第五附属医院,河南郑州市450052;华中科技大学同济医院,湖北武汉市430030;郑州大学第五附属医院,河南郑州市450052;郑州大学第五附属医院,河南郑州市450052;华中科技大学同济医院,湖北武汉市430030【正文语种】中文【中图分类】R741.05人诱导多潜能干细胞(human-induced pluripotent stem cells,iPSCs)是将特定的多能遗传基因导入体细胞获得的一种类似胚胎干细胞的多能干细胞。
周测小卷05（考查范围：第2章第2节）一、单选题1．通过特定方法，科学家将小鼠和人已分化的体细胞成功地转变成了类胚胎干细胞。
有关分化的体细胞和类胚胎干细胞的描述，正确的是（）A．类胚胎干细胞能够分化成多种细胞B．分化的体细胞丢失了某些基因C．二者功能有差异，但形态没有差异D．二者基因组相同，且表达的基因相同2．干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞，具有很强的分裂能力，在一定条件下，还可以分化成其他类型的细胞。
成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括造血干细胞、神经干细胞等。
下列叙述正确的是（）A．成体干细胞的分化程度低于胚胎干细胞，分裂能力高于胚胎干细胞B．骨髓移植治疗白血病利用了造血干细胞分化成各种血细胞的能力C．与小肠上皮细胞相比，同一个体胚胎干细胞中端粒酶的活性弱D．成体干细胞中基因都不表达时，细胞开始凋亡3．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不相符的是（）A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理一一酶的专一性B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性C．原生质体融合和动物细胞融合一一生物膜的流动性D．紫草细胞培养和动物细胞培养——细胞分裂4．下表为有关动物细胞培养与植物组织培养的比较，其中错误的是（）5．一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。
将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72 注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72 的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。
下列说法正确的是（）A．注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大B．单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合C．利用该小鼠只能制备出一种抗p72 的单抗D．p72 部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况6．如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。
临床医学中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 3 期 2008–01–15 出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2008 Vol.12, No.3小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞 生长状态★李 斌1,2，彭秋平2，卢伟英1,2，徐 雯1,2，金应霞2，黄元华1,2Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratiosLi Bin1,2, Peng Qiu-ping2, Lu Wei-ying1,2, Xu Wen1,2, Jin Ying-xia1, Huang Yuan-hua1,21AbstractAIM: The key of the human embryonic stem cell culture is to guarantee the totipotency and inhibit spontaneous differentiation. There are the problems in the traditional methods that human embryonic stem cells were cultured on the mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts as feeder layer. We aimed to solve the problems, observe growth state of human embryonic stem cells when it was cultured on the mixed feeder layers of different proportion. METHODS：Experiments were completed in Reproductive Medical Center of Hainan Medical College from April 2006 to July 2007. ①The foreskin was from the boy who was circumcised, provided by Department of Urinary Surgery of Hospital Affiliated to Hainan Medical College. Child guardian signed an informed consent of the treatment and experiment and the experiment was approved by the hospital medical ethics committee. Human embryonic stem cell line (HN-1) was isolated from human blastocysts and identified. Eleven clean fetal mice of 12.5-14.5 d were collected and the disposal of animal conformed to the animal ethics standards during the experiments. ②The fetal mice whose heads, limbs and internal organs were removed were repeatedly digested by the trypsin to obtain cells, then cells were cultured. Parts of the original cells were cryopreserved after confluence. It was the mouse embryonic fibroblast feeder layer that cells which were treated for 2.0-3.0 h with mitomycin C were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. Isolation, culture and preparation of feeder layer of human foreskin fibroblast were the same as above. Mixed feeder layer was that cells which were mixed according to 1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. ③Growth states of human embryonic stem cells were observed in three different feeder layers and undifferentiated phenotypes were detected, including expression of alkaline phosphatase, and presence of OCT-4, Tert and cell marker (OCT-4). Without feeder layer, human embryonic stem cell differentiation was observed in vitro. RESULTS：①Comparison of human embryonic stem cell growth state on different feeder layers: Colonies of human embryonic stem cells on the mouse embryonic fibroblast feeder layer and human foreskin fibroblast feeder layer was both flat and thin, but those on the mixed cells feeder layer were full and thick. The clonal morphology of the mixed feeder layer, overall, was significantly better than others. ②Comparison of human embryonic stem cell growth state on the mixed feeder layers prepared by different ratios: When mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts were mixed at a ratio of 1∶1 human embryonic stem cells accumulated significantly and cloning edge was clear, obvious and full. No significant changes were found at 1∶3. It was significantly better than others. ③Detection of human embryonic stem cell undifferented phenotypes on mixed feeder layer: Expression of alkaline phosphatase and OCT-4 antigen were strongly positive. Specific bands of OCT-4 and telomerase mRNA appeared respectively on 200-300 bp and 300-400 bp. ④Differentiation experiment in vitro: Human embryonic stem cells on mixed feeder layer was able to form embryoid bodies and differentiate into a variety of cells. CONCLUSION： ①Comparison with conventional feeder layers prepared by mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts, the mixed cells feeder layer may be better suitable for human embryonic stem cell culture in vitro and obtain better human embryonic stem cell clonal morphology. ②The feeder layer mixed at a ratio of 1∶1 can get better effect. Li B, Peng QP, Lu WY, Xu W, Jin YX, Huang YH.Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12 (3):424-428(China) [/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-424(ps).pdf] 摘要目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。
