亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究

按 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 方法［１５］， 并以牛血清蛋白作为标准蛋白 质。 １．２．４ 电泳分析
ＳＤＳ－ 聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献［１５］方法。分离 胶浓度为 １２ ％， 积层胶浓度为 ５ ％， 电极缓冲液： Ｔｒｉｓ－ 甘氨酸（ ｐＨ８．３） ； 上样后开始电泳时电流采用 １０ ｍＡ， 待 蓝色染料至浓缩胶和分离胶交界面处时， 将电流升至 ２０ ｍＡ。 １．２．５ 酶学性质 １．２．５．１ 亚基的相对分子质量测定
到目前为止， 国内外对亚硫酸盐还原酶的分离纯化 ［５～８］、生 理 功 能［９］、基 因 的 表 达 调 控［１０］、结 构 研 究［１１］及 其 应 用已有诸多报道。并已从植物、微生物等多种生物材料
基金项目：国家自然科学基金（ ２００７６０３０） 收稿日期：２００６－ ０４－ １２ 作者简介： 刘晓华（ １９７８－ ） ， 女， 在读硕士研究生， 主要从事环境生物工程的研究。 通讯联系人： 万海清， Ｅ－ｍａｉｌ： ｗｈｑｙｘｙ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
亚硫酸盐还原酶（ ＳｉＲ） 是催化亚硫酸盐还原为硫化 物的酶， 在 ＳＲＢ 生命活动中具有关键地位［１］。它广泛分 布于细菌、古细菌、真菌和植物中。ＳｉＲ 按催化过程中所 需辅酶可分为 ＮＡＤＰＨ－ ＳｉＲ 和 Ｆｄ－ ＳｉＲ， 在厌氧细菌和 真 菌 中 以 ＮＡＤＰＨ 为 辅 酶 ， 称 为 ＮＡＤＰＨ － ＳｉＲ（ ＥＣ １．８．１．２） ； 在 植 物 中 以 Ｆｄ 为 辅 酶 ， 称 为 Ｆｄ － ＳｉＲ（ ＥＣ １．８．７．１） ［２］。按功能、亚基组成和还原产物不同可分为同 化型亚硫酸盐还原酶（ ＡＳｉＲ） 和异化型亚硫酸盐还原酶 （ ＤＳｉＲ） ［３］。硫酸盐还原菌 （ＳＲＢ） 和一些厌氧细菌利用
盐还原酶的工业化生产及应用开发研究提供实验依据 １．２．２．４ ＤＥ－ ５２ 离子交换层析
和基础。
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把 经 Ｓｅｐａｄｅｘ Ｇ－ １００ 洗 脱 后 收 集 的 目 标 组 分 上 样
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 菌种与培养基
硫酸盐还原菌菌种由本实验室保存。发酵培养基， 参照 Ｌｅａｔｈｅｎ（ ＬＴＨ） 培养基［１３］， 并加以改良。 １．１．２ 试剂
ＤＳｉＲ 催 化 使 亚 硫 酸 盐 转 化 为 硫 化 物 或 者 连 三 亚 硫 酸 盐、连二亚硫酸盐； ＡＳｉＲ 能使单质硫转化为含氨基酸的 硫和在自然环境中对平衡硫的氧化还原起关键作 用［４］。 ＳＲＢ 的硫酸盐还原过程主要是异化型的。迄今为止， 所 有纯化的亚硫酸盐还原酶都含有一个或几个铁硫中心， 大都以 ＮＡＤＰＨ 或甲基木精素作为电子受体。
于 ＤＥ－ ５２ 层 析 柱 （ "２．６×５６ ｃｍ） ， 该 层 析 柱 已 用 ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 磷 酸 钾 （ ｐＨ７．７） 缓 冲 液 预 平 衡 。 调 节 流 速 为 ２ ｍＬ／ｍｉｎ， 用 约 ６００ ｍＬ 含 ＮａＣｌ ０．１～１．０ ｍｏｌ／Ｌ（ ｐＨ ７．７） 的 ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸钾缓冲液直线盐梯度洗脱， 测定各收 集管液的酶活力及蛋白质含量。 １．２．３ 蛋白质含量的测定
将发酵液于 ４０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ， 除去菌体等大 体积物质， 取上清液即为粗酶液。 １．２．２．２ （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 分级沉淀
向粗酶液中加固体（ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 至含量达 ３０ ％， 边加 边搅拌， 搅拌 １ ｈ， 使盐析完全让杂蛋白沉淀。于 １００００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心 ３０ ｍｉｎ， 取上清液。向上清液中继续缓慢 加入（ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 至 含 量 达 ５０ ％， 边 加 边 搅 拌 ， 搅 拌 １ ｈ， 使目标蛋白析出。于 １００００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心 ３０ ｍｉｎ 收集 沉淀。
将酶液与不同 ｐＨ 缓冲液配置的底物溶液进行反应 （ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 醋酸盐缓冲液， ｐＨ３．０～５．０； ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 甘氨酸 － 氢氧化钠缓冲液， ｐＨ９．０～１０．０； 其余用 ＰＢＳ 缓冲液） ， 按照标准方法测定酶活， 以酶活最高者为 １００ ％。 １．２．５．４ 酶的稳定性研究
①热稳定性的测定 分别测定酶在最适 ｐＨ 值时对酶的热稳定性。将酶 液与 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸钾缓冲液分别在不同温度下（ ２０～ ６０ ℃） 保温 ２ ｈ 后， 立即在 ４ ℃冰箱中冷却， 然后按照标 准方法测定酶活， 以未经保温处理的酶活为 １００ ％。
ＮＡＤＰＨ， 考 马 斯 亮 蓝 Ｇ－ ２５０， 牛 血 清 白 蛋 白（ＢＳＡ） （ 华 美 公 司 进 口 分 装 ， Ｂｉｏｍｏ 公 司 生 产） ； Ｓｅｐａｄｅｘ Ｇ － １００， ＤＥＡＥ－ ５２（ 华美进口分装， Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公司生产） ； 溶 菌 酶 （ 北 方 同 正 进 口 分 装 ， Ｓｉｇｍａ 公 司 生 产 ） ； Ｔｒｉｓ （ Ｐｒｏｍｅｇａ 公司生产） ； 十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）（ Ｂｉｏｍｏ 公 司生产） 。其余均为国产分析纯。 １．２ 方法 １．２．１ 亚硫酸盐还原酶活力测定
按 Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ［１４］方法略做修改， 移取 １ ｍＬ 酶液于试 管中， 分别加入 ５ ｍＬ ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ７．７ 的磷酸钾液含 ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ 缓 冲 溶 液 、１ ｍＬ ０．０２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨ 和 ５ ｍＬ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＳＯ３ 作 为 电 子 接 受 体 。 在 ２５ ℃水浴中培养 ５ ｍｉｎ 后， 测光吸收值 Ａ３４０ 的减少 量。以不含酶液和 ＮＡＤＰＨ 的体系作为对照， 根据标准 曲线确定反应液中 底 物 ＮＡＤＰＨ 的 摩 尔 浓 度 来 计 算 酶 活力单位数（ 酶活力单位的定义： ２５ ℃， 以 １ ｍｉｎ 催化 １ μｍｏｌ ＮＡＤＰＨ 氧化所需的酶量为 １ 个活力单位 ｕ） 。 １．２．２ 亚硫酸盐还原酶的分离纯化方法 １．２．２．１ 粗酶液的制备
过程中， 可以通过检测亚硫酸盐还原酶的酶活力来判断 后 冰 冻 干 燥 浓 缩 。 然 后 将 酶 液 加 到 含 ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｈ２Ｓ 的释放量， 进而 采 取 相 应 的 措 施 减 少 管 道 、容 器 的 Ｎａ２ＥＤＴＡ， ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ３ＰＯ４， ｐＨ 为 ７．７ 的缓冲液预平衡
刘晓华，万海清·亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究
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中分离纯化得亚硫酸盐还原酶。由于亚硫酸盐还原酶能 １．２．２．３ Ｓｅｐａｄｅｘ Ｇ－ １００ 柱层析
催化亚硫酸盐还原， 参与生物硫循环， 所以颇具环保意 义。同时在食品行业也发挥着重要的作用， 如白酒生产
将 沉 淀 物 用 适 量 含 ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ， ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ３ＰＯ４， ｐＨ 为 ７．７ 的 缓 冲 液 溶 解 ， 透 析 脱 盐 ， 脱 盐
腐蚀程度； 在提高鲭凝胶特性方面， 亚硫酸盐还原酶能 过的 Ｓｅｐａｄｅｘ Ｇ－ １００ 柱（ !２．６×８０ ｃｍ） 上， 调节流速约为
替代化学还原试剂使肌动球蛋白复原和冻干的鲭恢复 ０．６ ｍＬ／ｍｉｎ， 用相同的缓冲液洗脱。测定各收集管酶活力
活性［１２］。因此， 研究其分离纯化、性质等， 以便对亚硫酸 及蛋白质含量。
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酿酒科技 ２００６ 年第 ６ 期（ 总第 １４４ 期）·ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００６ Ｎｏ．６（Ｔｏｌ．１４４）
亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究
刘晓华，万海清 ＊
（ 四川大学化学工程学院， 四川 成都 ６１００６５）
摘 要： 采用硫酸铵盐析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ １００ 凝胶过滤、ＤＥＡＥ－ ５２ 纤维素柱层析一系列纯化步
骤，得到电泳纯的亚硫酸盐还原酶，纯化倍数为 １１５．３０，酶回收率为 １８．３６ ％。用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 测得
亚基相对分子质量为 ６６ ｋＤａ。酶反应的最适温度和 ｐＨ 分别为 ３０ ℃和 ７．７。热稳定性较好，８０ ℃
时酶活仍能维持在 ５５ ％左右。在 ｐＨ ４～１０ 之间均较稳定，残余酶活均在 ６０ ％以上。Ｆｅ３＋，Ｚｎ２＋，
Ｃｕ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋ 对亚硫酸盐还原酶有明显的抑制作用，Ｃａ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋，Ｆｅ２＋ 对亚硫酸盐还原酶有轻
微的抑制作用，其他离子在实验浓度范围内对酶活无明显影响。以亚硫酸钠为底物，该酶的 Ｋｍ
为 １．２３ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ 为 ６．８０ ｕ／ｍＬ。
关键词： 微生物； 亚硫酸盐还原酶； 分离纯化； 酶学性质
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１００６５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ， Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ １００ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＥＡＥ－ ５２ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ａ １１５．３０－ ｆｏｌｄ－ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ １８．３６ ％． Ｉｔｓ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ６６ ｋＤａ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ３０ ℃ ａｎｄ ７．７ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｔ ８０ ℃， ｔｈｅｒｅ ｓｔｉｌｌ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｂｏｕｔ ５５ ％ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｇｏｏｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）． Ｉｔ ｗａｓ ｉｎ ｓｔａｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ４ ａｎｄ １０ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｒｅｄｕｃ－ ｔａｓｅ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ６０ ％ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｔｈｅ ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｅ３＋， Ｚｎ２＋， Ｃｕ２＋， Ｍｎ２＋， Ｃｏ２＋， ａｎｄ ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａ２＋， Ｚｎ２＋， Ａｇ＋， Ｆｅ２＋ （ｏｔｈｅｒ ｉｏｎｓ ｈａｄ ｎｏ ｅｖｉｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｉｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）． Ｉｔｓ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｗｅｒｅ １．２３ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ６．８０ ｕ／ｍＬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｅ； ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ； ｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
中图分类号： ＴＱ９２０；Ｑ８１４ 文献标识码：Ａ
文章编号：１００１－ ９２８（６ ２００６）０６－ ００２８－ ０４
Ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ＆ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｔｓ Ｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒ ｏｐｅｒ ｔｉｅｓ
ＬＩＵ Ｘｉａｏ－Ｈｕａ ａｎｄ ＷＡＮ Ｈａｉ－Ｑｉｎｇ
将 样 品 与 已 知 分 子 量 的 标 准 蛋 白 质 进 行 ＳＤＳ － ＰＡＧＥ 电泳， 然后以相对迁移率对分子量对数作图， 从 图中求出亚硫酸盐还原酶的亚基相对分子质量。 １．２．５．２ 最适温度的测定
在 ｐＨ７．０ 的条件下， 于 １５～８０ ℃温度范围内按照 标准方法测定酶活， 研究不同温度对酶活力的影响， 以 酶活最高者为 １００ ％。 １．２．５．３ 最适 ｐＨ 的测定