亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究

碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。

含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。

根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。

酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。

关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。

此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。

它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。

药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。

它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。

临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。

因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。

本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。

此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究胡元森;潘涛;李翠香【摘要】纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%.酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60 kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5 0,该酶在pH3 4-6 0下稳定,高温耐受性差.Cu~(2+)、Zn~(2+)、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)和Mn~(2+)对酶具有较强的激活作用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)003【总页数】4页(P199-202)【关键词】酸性α-淀粉酶;蛋白纯化;酶学性质【作者】胡元森;潘涛;李翠香【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052;河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052;河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052【正文语种】中文目前,国内外市场中两类常用的淀粉酶为中温和高温α-淀粉酶,其适用 pH范围为6-7,在酸性条件下其酶活性明显降低[1]。

酸性α-淀粉酶在低 pH条件下以随机方式切断淀粉分子内的α-1,4-糖苷键,能满足一些酸性条件下淀粉原料的深加工工艺要求[2]。

此外,酸性α-淀粉酶因其具有在酸性条件下发挥作用的特性,可广泛应用于发酵饮料、青贮饲料、医药等多种领域。

自 1963年日本研究者发现 Aspergillus niger可以产酸性α-淀粉酶以来,许多学者开始对其进行研究。

例如,刘永乐等[3]筛选到一株产酸性淀粉酸的黑曲霉菌株AS-Y,并对其固态发酵条件进行了优化。

陈波等[4]从土壤中分离到一株产酸性α-淀粉酶的青霉菌株,最适作用 pH4.4,最适作用温度为60℃。

收稿日期:2004 -6 -16作者简介:苏昕(1966 -),女(汉族),辽宁沈阳人,讲师,硕士,主要从事微生物与生化药学研究,Tel.024 -23843711 -3513,E-mailsuxin660511@。

文章编号:1006 -2858(2005)01 -0067 -04酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究苏昕,阎浩林,梁丽莉(沈阳药科大学制药工程学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的发酵培养Y12酵母菌分离制备酵母SOD并研究其部分酶学性质。

方法用已筛选出的一株Y12酵母菌对其在优化培养条件下发酵培养得到湿菌体,破壁抽提得SOD粗酶液,采用硫铵盐析、丙酮沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和QAE-Sephadex A-50离子交换柱层析,分离得到酵母SOD并测定其部分酶学性质。

结果Y12酵母菌SOD产量达1 263 u#g-1湿菌体,分离得到酵母SOD,该酶属Cu、Zn-SOD,比活力为1 07315 u#mg-1,活力回收率为5411 %,紫外吸收峰在25712 nm,分子质量为32 456 u,亚基分子质量为16 227 u。

结论此酵母SOD与文献中报道的动物血红细胞Cu、Zn-SOD基本相近。

关键词:酵母SOD;分离纯化;酶学性质中图分类号:Q 554 文献标识码:A超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种含有铜、锌、铁、锰的新型金属酶,1969年由Mccord和Fridovich发现其能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应而命名[1]。

SOD是机体内的唯一以超氧阴离子为底物的酶,能维持细胞内氧自由基处于无害低水平状态,是进行需氧代谢的生物维持生存所必需的酶。

由于SOD广泛存在于生物界,能专一清除超氧阴离子自由基,已引起国内外生化界和医药界的极大关注。

近年来,国外利用微生物发酵生产SOD的相关报道很多[2]。

其中发酵法生产SOD是一条经济可行的途经[3]。

化学与生物工程2009,Vol.26N o.3Ch emistry &B ioengin eerin g15基金项目:国家科技支撑计划资助项目(2008BA D91B01),北京市科技新星计划资助项目(2006B22)收稿日期:2008-11-13作者简介:刘灵芝(1983-),女,河南人,硕士研究生,研究方向:生物化工;通讯联系人:罗晖,副教授。

E -mail:luohui99@y aho o. 。

过氧化氢酶的研究与应用新进展刘灵芝1,2,钟广蓉1,熊 莲1,2,常雁红2,肖宝清2,罗 晖1(11北京科技大学生物科学与技术系,北京100083;21北京科技大学环境工程系,北京100083)摘 要:过氧化氢酶是一种广泛存在于好氧微生物和动、植物体内、催化效率较高且具有重要工业应用价值的酶。

在论述过氧化氢酶的类型划分、结构特点和功能的基础上,阐述了过氧化氢酶的分离纯化和极端环境下微生物产过氧化氢酶的研究进展,并对过氧化氢酶在食品、环保、造纸、纺织等行业中的应用进行了介绍。

关键词:过氧化氢酶;极端微生物;应用;进展中图分类号:Q 814 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2009)03-0015-04过氧化氢酶(H ydrog en pero xidase)又称触酶(Catalase,CAT ),是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是以过氧化氢为底物,通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气。

该酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一,并在食品、医药、纺织、造纸、环保等行业具有重要的应用[1,2]。

1 C AT 的来源及分类迄今为止的研究表明,几乎所有需氧微生物中都存在CAT ,动物肝脏、红细胞、植物叶绿体等也含有大量CA T 。

早期按来源不同CA T 被划分为真核CAT 和原核CAT,真核CAT 主要来源于动植物组织,原核CA T 主要来源于微生物。

亚硝酸钠作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉制品加工中被广泛使用。

然而亚硝酸盐残留过高对人有极大危害，食品中亚硝酸盐含量一直是食物安全性的焦点之一。

世界上许多国家呼吁严格控制亚硝酸或硝酸盐使用量，目前国内外都在研究一种既能使香肠色泽鲜艳持久，保鲜性能好，又能降低和消除亚硝酸盐残留量的香肠生产方法，但迄今还未有一种理想的生产方法[1]。

降低肉制品中亚硝酸盐含量的方法主要有化学方法和生物方法。

化学方法主要集中在利用发色剂或防腐剂等替代物减少亚硝酸盐的添加量，但不能完全替代亚硝酸盐的应用，对最终亚硝酸盐的残留量不能控制[2]。

生物方法主要是利用微生物作为发酵剂降低肉制品中的pH 值[3-6]、产生的亚硝酸还原酶（NiR ）来降解肉制品中的亚硝酸盐[7-9]，能够使肉制品中亚硝酸盐的残留量控制在较低的水平，但目前生物方法的研究和应用主要集中在发酵香肠中利用微生物降低亚硝酸盐残留量，而对于肉制品加工过程中添加NiR 酶制剂来控制品质和亚硝酸盐残留量方面还较少有人研究，主要是由于还未获得适用于肉制品高温、高盐等加工条件且可工业化生产的NiR 酶制剂[10]。

NiR 是催化亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO ）的酶[11]。

在肉制品加工过程中添加亚硝酸盐的目的是使其产生NO ，NO 再与肉中的高铁肌红蛋白在加热条件下生成呈色物质。

因此，若能在肉制品加工过程中将NiR 作为酶制剂加入，一方面将加快NO 的产量和速率，减少了亚硝酸盐的添加量；另一方面该酶会将残留的亚硝酸盐全部催化为NO ，这样不但能获得色泽鲜艳、保鲜性能好的肉制品，而且将极大地降低肉制品中亚硝酸盐的残留，甚至可获得无亚硝酸盐残留肉制品。

国外有研究将NiR 直接加入香肠中以降解残留的亚硝酸盐，但由于所获得的酶类不能耐受高温，不能完成在香肠加工快速升温过程中酶解过程。

一般的酶制剂在该条件下已完全失活[10，12]。

因此，若能够获得在加热后还具有酶活性的NiR ，将对于利用生物法降低亚硝酸盐残留量起到重要作用。

乙醇脱氢酶的初步分离及其酶学性质的研究吴桂英;金放;吴元欣;赵玉凤【摘要】以硫酸铵为沉淀剂,采用盐析法对乙醇脱氢酶(ADH)进行了初步的分离纯化,ADH比活力从粗酶液的0.464 U·mg-1提高到1.198 U·mg-1,纯化倍数为2.582.研究了ADH的基本酶学性质,其最适作用pH值为7.0～10.0,pH值为8.0时酶活力达到最大,pH值为7.0时酶较为稳定;最适作用温度为37℃,温度为30～40℃时酶活力较为稳定,温度超过45℃后酶活力急剧下降.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2009(026)006【总页数】3页(P69-71)【关键词】乙醇脱氢酶;分离;酶学性质【作者】吴桂英;金放;吴元欣;赵玉凤【作者单位】黄石理工学院化学与材料工程学院,湖北,黄石,435003;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430073;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430073;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430073【正文语种】中文【中图分类】Q554.9酒精对肝脏、肾脏、胃肠道、神经系统、循环系统都有一定毒性，一些口腔癌、咽癌、喉癌、结肠癌及上呼吸道癌患者与过量饮酒也有密切关系[1]，由此可见酗酒对身体有害。

国内外解酒饮品多为单纯兴奋剂,进入机体产生类质激素效应,从而“中和”乙醛对人体中枢神经系统的抑制作用,起到醒酒效应,仅为“治标”，并且其“醒酒”功能成分多为化学合成物质,成本也较高。

乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶[1] ,一种是乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)[2～5],另一种是乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)[4,6]。

前者使乙醇转化为乙醛,后者使乙醛进一步转化为乙酸,最终分解为二氧化碳和水，由此可以看出ADH是乙醇在人体内代谢的必需酶。

由于微生物发酵的生产周期短,培养基价格低廉,酶制剂可以实现大规模、低成本的工业化生产,因此从微生物细胞中提取ADH[7～9]并制成酶制剂具有广阔的市场前景。

拟南芥亚硫酸盐氧化酶基因AtSO启动子的分离与功能分析夏宗良;王美平;刘全军【期刊名称】《植物生理与分子生物学学报》【年(卷),期】2007(33)5【摘要】亚硫酸盐氧化酶(SO)作为目前发现的钼酶家族成员之一,在哺乳动物硫化物的脱毒、嘌呤代谢等过程中起着非常重要的作用.然而,很少有关于高等植物SO 的表达和调控机制的研究报道.本研究中,我们用半定量RT-PCR和组织化学方法对拟南芥中SO基因AtSO的表达调控进行了初步研究.结果表明,AtSO在拟南芥的地上部分如茎、叶、花和未成熟荚果中有较高的表达水平,而在根部表达水平较低.在对分离的该基因上游1 562-bp的启动子区域进行生物信息学分析时,鉴定出一些可能的调控元件如光调控元件(LRE).转基因植株中AtSO启动子驱动下的GUS 基因(uidA)表达结果表明:AtSO的表达主要在植物的地上组织,表达具有光依赖性,且表达水平受亚硫酸盐的诱导增高.这一结果对进一步研究SO在植物对光周期和亚硫酸盐胁迫应答反应中的作用提供线索.%Sulfite oxidase(SO),one of the known molybdenum co-factor-containing enzymes,plays important roles in diverse metabolic processes such as sulfur detoxification and purine catabolism in mammals.But much less is known about the expression and regulatory characterization of sulfite oxidase gene in higher plants.In this report.expression of Arabidopsis SO is characterized in detail by semi-quantitative RT-PCR and histochemical staining.The results showed that the transcripts of AtSO were predominantly detected in Arabidopsis aerial tissues including stems,young leaves,young inflorescences and immaturesiliques at higher level.but in roots with a lower level.To monitor AtSO expression in plant,the promoter region containing a 1 562-bp genomic sequence from AtSO was isolated and analyzed using methods of bioinformatics.Basing on the distribution of beta-glucuronidase(GUS)activities shown by histochemical staining in transgenic Arabidopsis plants harboring the promoter-uidA fusion construct,it can be concluded that AtSO is expressed mainly in the green tissues/organs in a light-dependent way.In addition,its expression is up-regulated during sulfite treatment.The information from this study may provide useful clue for further functional analysis of plant SO homologs during light-induced development of leaf tissue and/or excessive sulfite/SO2 gas stresses in higher plants.【总页数】6页(P369-374)【作者】夏宗良;王美平;刘全军【作者单位】河南农业大学,生命科学学院,郑州,450002;河南农业大学,图书馆,郑州,450002;河南农业大学,生命科学学院,郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】Q74【相关文献】1.拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析 [J], 张秀春;吴坤鑫;孙建波;夏亦荠;彭明;李文彬2.拟南芥AtLURP1基因启动子在转基因烟草和水稻中的功能分析 [J], 刘志钦;马小玲;严雁;黄雪盈;蔡金森;陈伟;石兰平;王博;牟少亮3.拟南芥AtNUDT8启动子的分离及其功能分析 [J], 张秀春;吴坤鑫;李文彬;夏亦荠;彭明4.沟叶结缕草ZmPSY基因启动子对拟南芥的转化及功能分析 [J], 于安东;滕珂;檀鹏辉;董笛;尚明娟;常智慧5.拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析 [J], 张秀春;李若霖;唐文;夏亦荠;彭明;吴坤鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

酶的分离纯化---介绍酶分离纯化的步骤、原则和评价方法⏹酶的分离提纯●酶分离纯化的目的：研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能的关系、阐明代谢途径；作为生化试剂和药物。

●酶提纯主要包括：酶制剂的浓缩；杂蛋白和杂质的去除●分离纯化方法的衡量指标总活力回收；比活力提高的倍数。

材料处理抽提分离纯化鉴定机械、化学，组织/细胞破碎,蛋白质释放缓冲液、离子浓度pH，蛋白质溶解到缓冲液，盐析、有机溶剂、等电点、吸附、超滤，缩小体积离心离心离子交换、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析、高效液相、快速蛋白质液相层析、电泳、结晶电泳、结晶、溶解度、高效液相，二种以上分子量、等电点、活性酶总活力比活力回收率纯化倍数酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶的分离提纯过程⏹评价指标●总活力=活力单位数/ml×总体积（ml）●比活力=活力单位数/ mg蛋白（氮）=总活力单位数/ 总蛋白（氮）mg ●纯化倍数=每次比活力/第一次比活力●回收率=每次总活力/第一次总活力某科研人员在对酶分离纯化过程中得到以下实验结果：请根据上述实验结果回答以下问题：⑴在六部分离纯化过程中，哪一步（A）分离效果最好，哪一步（B）分离效果最差？依据是什么？⑵上述A和B步骤分离纯化方法的原理是什么？⑶该酶是否已经纯化？还可以用什么方法确定其纯度？分离步骤总蛋白质含量(mg) 活力单位数1 粗分离20 000 4 000 0002 盐析 5 0003 000 0003 等电点分离4 000 1 000 0004 离子交换200 900 0005 亲和层析50 750 0006 分子筛层析45 675 000分离步骤总蛋白含量mg 活力单位数比活力回收率纯化倍数1粗分离20 000 4 000 00020010012盐析 5 000 3 000 0006007533等电点分离 4 000 1 000 00025025 1.254离子交换200900 000450022.522.55亲和层析50750 0001500018.75756分子筛层析45675 0001500016.8875回收率=100*每一步的活力单位数/第一步的活力单位数纯化倍数=每一步的比活力/第一步的比活力取XXmL 酶液测定其中蛋白质的含量，换算总蛋白含量取XXmL 酶液测定其中酶活力单位数，换算活力单位数总活力数/总蛋白含量宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀21 2980 141 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶0.12 130 1072 19.70 3。

收稿日期:2007-12-28;修回日期:2008-03-09作者简介:潘柯樾(1983-)女,硕士研究生,主要从事环境微生物的研究.通讯作者:万海清.E -mail :wh qyxy @sohu .com文章编号:　0490-6756(2008)04-0997-04一株胞外产亚硫酸盐还原酶功能菌的分离及酶学性质的初步研究潘柯樾,万海清,冉　(四川大学化工学院,成都610065)摘　要:分离筛选出一株产亚硫酸盐还原酶活能力高的细菌,初步鉴定该菌属于脱硫弧菌属,该菌兼性厌氧,产胞外亚硫酸盐还原酶.对分离菌所产亚硫酸盐还原酶进行初步的酶学性质研究发现:该酶在条件为25～40℃、pH 7～8范围内时,酶活性较高;酶的最适温度为30℃、最适pH 为7.7;该酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,80℃下放置2h ,酶活仍可保留55%左右,在pH 4～10的条件下,酶活可达60%以上.关键词:脱硫弧菌;分离;亚硫酸盐还原酶;性质中图分类号:Q93 文献标识码:AIsolation of a extracellular sulfite reductase pru ducing bacteria andstudies on the characteristic of enzymologyP AN Ke -Y ue ,W AN Hai -Qing ,R AN Y i(College of Chemical Engineering ,Sichuan U niversity ,Chengdu 610065,China )A bstract :A strain high sulfite reductase activity bacteria w as isolated .It w as identified that the obtainedstrain belonged to facultative anaerobic bacteria of D .desulf uricans ,producing ex trac ellular sulfite reduc -tases .The enzy mology characteristic of the enzy me w as preliminarily researched .The optimal temperature and pH fo r the enzy me reactivity w ere 30℃and 7.7respectively .The enzyme had a hig h activity in the range of 25～40℃and pH 7～8.About 55%activity w as reserved after two hours at 80℃,and more than 60%ac -tivity was reserved after tw o hours at pH 4～10,showing a good thermal stability and pH stability .Key words :D .desulfuricans ,isolation ,sulfite reductase ,characteristic1　前　言亚硫酸盐还原酶(Sulfite reductase ,SiR )具有催化亚硫酸盐还原为硫化物的作用,在生物圈的硫循环中扮演着重要的角色[1].按功能可分为同化亚硫酸盐还原酶和异化亚硫酸盐还原酶[2].同化亚硫酸盐还原酶主要分布在植物中,将环境中的无机硫转化为氨基酸中的硫;异化亚硫酸盐还原酶主要分布在细菌、真菌以及古细菌中,催化亚硫酸盐还原为硫化物或者连三亚硫酸盐、连二亚硫酸盐.亚硫酸盐还原酶以Fd 或NADPH 作辅酶[3]转递电子.在还原硫酸盐的厌氧细菌中,广泛含有异化亚硫酸盐还原酶,并以NADPH 作为辅酶.目前,SiR 已应用于食品行业中[4-5].本实验分离筛选出一产胞外SiR 的菌株,为亚硫酸盐的工业化生产和应用提供参考.2008年8月　第45卷第4期　四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition )　Aug .2008Vol .45　No .42　材料与方法2.1　材　料2.1.1　菌种来源　实验室自主分离并保存的菌种,经过驯化,筛选出胞外产亚硫酸盐还原酶能力高的菌株.2.1.2　培养基　富集培养基:参照LTH培养基配制,并对其组分予以适当的调整[6].分离培养基:参照改良的Miller培养基[7].2.2　实验方法2.2.1　菌种的活化、富集与纯化　将保存菌种置于25℃下活化2d后,按10%的接种量接入富集培养基中,30℃下厌氧培养5～7d.采用平板稀释涂布法[10],对富集菌液进行涂布分离.30℃厌氧培养5～7d.挑选单个的黑色菌落,接入富集液体培养基中,30℃发酵2d后,测定产酶活.利用此法对产酶量较高的富集液进行重复纯化,最终筛选出产酶活高的纯菌株.2.2.2　分离菌株的生理生化特性分析　观察分离菌的形态、大小、菌落特征和染色情况,测定分离菌对氧的耐受能力和过氧化氢酶活性[10,11].2.2.3　酶活力与生物量的测定　本实验利用紫外分光光度计,测定NADPH在340nm处吸光值的变化量,计算出酶活力[8,9].生物量的测定采用分光光度计法测量OD605值.2.2.4　功能酶存在部位分析　培养2d的菌液, 4000r/min离心20min,取上清液即可测得分布在细胞外的酶活力.离心沉淀经溶菌酶处理后,再次4000r/min离心20min,取上清液,测得分布在细胞中的酶活力[12].2.2.5　粗酶制备　富集培养2d的菌液,4000r/ min离心20min,取上清液即为粗酶液.2.2.6　最适温度和pH　按照2.2.3所示的方法测定酶活力,其测试体系中的磷酸盐缓冲液分别由下列不同pH的缓冲体系代替.(pH3.0～5.0的0.1mol/L醋酸盐缓冲液,pH9.0～10的0.1mol/ L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,其余为PBS缓冲液).在最适pH下,将体系保温于不同的温度,加入酶液,测定酶活力.2.2.7　酶的稳定性　在最适温度下,将酶液置于不同pH的缓冲溶液中,2h后调回原pH测酶活.0时刻的酶活计为100%.在最适pH下,将酶液置于不同温度中保温2 h后测酶活.0时刻的酶活计为100%.3　结果与分析3.1　细菌的生理生化特征3.1.1　菌体表征　分离菌液体培养,第2d菌液出现黑色混浊;第3d菌液全部变黑,瓶壁上附着黑色沉淀;醋酸铅试纸检测表明有H2S气体溢出.平板生长时,菌落第1～2d呈乳白色,圆形,直径1.0～2.0mm,表面圆滑、湿润;生长后期(5～6d),菌落呈黑色,并深深的包埋于培养基中,表面有微小凸起,而且菌落向四周延伸.镜鉴表明:分离菌为单细胞,革兰氏染色呈阴性、无芽孢、单极生鞭毛.活体观察发现细胞呈摇摆式运动.生长初期,细胞粗长,0.8～1.0×3.0～8.0mm;生长过程中细胞变细变短,最终变为细小弧状、杆状,0.4～0.5×1.0～3.0mm.根据伯杰氏细菌鉴定手册[13],初步鉴定该菌株属于脱硫弧菌属细菌(见图1).图1　细菌在光学显微镜下的形态(×1600)Fig.1　M orphology of the bacteria underphotomicroscope(×1600)3.1.2　对氧气的耐受性能　把菌液接入固体富集培养基培养2d后,在试管中下部出现黑色沉淀;3～4d后,在试管上部以及培养基表面固气接触处,有黑色沉淀生成.说明:分离菌在有氧气存在的环境下仍然能够生长,但菌的生长情形比厌氧环境下差.3.1.3　过氧化氢酶的检测　将菌苔挑入H2O2溶液中混合,有气泡出现,说明分离菌株的生长菌苔具有过氧化氢酶活性,从而也说明分离菌细胞体内可能存在着去除有害活性氧的机制,该菌属于兼性厌氧菌.3.1.4　菌的产酶能力　在同样的培养条件下,测得分离纯化前后菌液的产酶活的大小和菌液中的细胞浓度,如表1所示.比较发现:分离纯化后菌液单位浓度产酶活性是分离纯化前的4.525倍,产酶能力明显增高.说明通过驯化,分离菌株细胞内的998四川大学学报(自然科学版)第45卷亚硫酸盐还原酶合成调节机制,能更适合现有底物水平,合成出更多的目标酶.表1　分离纯化前后菌种产酶能力比较T ab .1　Comparisio n of the enzyme productionbefore and after isolation菌株分离纯化前分离纯化后酶活(U /m L )1.2765.147OD 6051.0820.965单位菌浓度产酶活(U /mL )1.1795.3353.2　SiR 酶分布部位的确定采用溶菌酶法破碎细胞壁,分别测定细胞内、外酶活力大小.菌液离心后,上清液中测得酶活力(即分布在细胞外的酶活)为4.753U /mL .沉淀经溶菌酶处理后,上清液中酶活(分布在细胞内的酶活)为0.188U /m L .胞外分布的酶活力明显高出胞内分布的酶活力,而且胞内酶活力几乎为零.可认为,分离菌株所产SiR 为几乎全部分泌到细胞外环境中,属于胞外酶.图2　pH 对酶活力的影响Fig .2　Effect of pH on the enzy me3.3　粗酶液的酶学性质3.3.1　酶的最适pH 和温度　通过测定不同pH 值和温度下酶的活力,从图2可看出,酶作用的pH 范围较宽,pH 4～10范围内,都可测到酶活.pH 7～8之间酶活最高,最适pH 为7.7.从图3可知,酶的最适温度为30℃,25℃～40℃之间酶活较高.温度对酶活的影响比较明显:当温度低于30℃时,酶活随温度的上升迅速增加;当温度高于30℃时,由于酶蛋白的热变性,酶活随温度的上升逐渐下降.图3　温度对酶活力的影响Fig .3　Effect of temperature on theenzyme图4　pH 对酶稳定性的影响F ig .4　Effect of pH o n the enzymestability图5　温度对酶稳定性的影响Fig .5Effect of temperature on the enzyme3.3.2　酶的稳定性　在最适温度下,将酶液置于不同的pH 的缓冲溶液中,2h 后调回原pH 测酶活.由图4可知,处理后的酶活力在pH4.0～10之间都较稳定,残余酶活在60%以上,pH 7.7时酶的稳定性最高,30℃放置2h ,酶活仍然保留85%左右.在最适pH 下,将酶液置于不同温度中保温2h999第4期潘柯樾等:一株胞外产亚硫酸盐还原酶功能菌的分离及酶学性质的初步研究　后测酶活.如图5所示酶的热稳定性较好,10～30℃下放置2h,酶的残余活力可保持在90%以上,在80℃放置2h,残余酶活仍可维持在55%左右.4　小　结本实验通过对保存菌种的驯化、筛选,得到一株高产酶的纯菌株,并对该菌及其所产亚硫酸盐还原酶进行研究,表明:(1)对分离菌进行生理生化特征测定,初步鉴定该菌株为兼性厌氧的脱硫弧菌属细菌.(2)通过分离筛选,菌种的单位细胞浓度产酶量从1.179U/m L增加到了5.335U/mL,产酶能力有明显提高.(3)采用溶菌酶破碎细胞,测定分离菌所产的亚硫酸盐还原酶为胞外酶.(4)对粗酶液的酶学性质进行初步的研究.该分离菌所产亚硫酸盐还原酶的最适温度为30℃,最适pH为7.7.温度在25～40℃之间,和pH7～8之间,酶活较高.具有较好的热稳定性和酸碱稳定性.80℃下放置2h,可保留55%左右的酶活, pH4～10的范围内,酶活可保存60%以上.参考文献:[1]　M asato N,T etsuyuki A,Toshiharu H.Plant sulfite re-ductase:mo lecular structure,catalytic function and inter-action with ferredoxin[J].Journal of Ino rganic Bio-chemistry,2000,82:27.[2]　Brian R C,Elizabeth D G.T he relatio nship betw eenstructure and function for the sulfite reductases[J].Cur rent Opinio n in Structural Biology,1996,6:744.[3]　Christoph V A,Christian B.M easurement of ferredox-in-dependent sulfite reductase activity in crude ex tr actsfro m leaves using O-A cetyl-L-Serine sulfhy drylase in acoupled assay sy stem to measure the sulfide formed[J].A nal Biochem,1983,131:198.[4]　Jiranek V,Langridge P,Henschke P A.Regula tio n ofhy drogen sulfide liberation in win-producing Saccha-romy ces cerevisiae strains by assimilable nitrogen[J].A ppl Enviro n M icrobio l,1995,61(2):461.[5]　Yin L J,Lin H Y,Jiang S T.Purification and charac-terization of escherichia coli sulfite reductase and its ap-plication in surimi processing[J].Journal of Food Sci-ence,2002,67(9):3329.[6]　郑士民,颜望明,钱新民.自养微生物[M].科学出版社,1983.[7]　郭爱莲,侯静芬,黄淑菊.脱硫弧菌的分离研究[J].西安大学学报:自然科学版,1995,25:45.[8]　王坤,施前.适用诊断酶学[M].2版.上海医科大学出版社,2000.[9]　Jacek O,Wu J Y,David C R,et al.Characterizatio no f the cy sJIH regions o f Salmonella ty phimurium andEscherichia coli B[J].J Bio Chem,1989,264(26):15726.[10]　沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,1998.[11]　李亚新,陈丽华.利用硫酸盐烟道气生物脱硫技术[J].环境科学与技术,2003,(3):51.[12]　孙彦.生物分离工程[M].北京:化学工业出版社,1998.[13]　布坎南R E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984.[责任编辑:白林含]1000四川大学学报(自然科学版)第45卷。

第38卷第4期2014年7月南京林业大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition ）Vol．38，No．4Jul．，2014doi ：10．3969/j．issn．1000－2006．2014．04．021收稿日期：2013－05－02修回日期：2014－02－24基金项目：江苏省科技创新与成果转化专项项目（BE2010689）；国家自然科学基金项目（30471360）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD ）第一作者：侯光北，硕士。

*通信作者：翟华敏，教授。

E-mail ：hzhai@njfu．edu．cn 。

引文格式：侯光北，冯年捷，张琳，等．麦草碱性亚硫酸盐制浆废液的木聚糖酶解特性［J ］．南京林业大学学报：自然科学版，2014，38（4）：113－117．麦草碱性亚硫酸盐制浆废液的木聚糖酶解特性侯光北1，冯年捷1，张琳1，戴铠1，王崎1，翟华敏1*，薛希华2（1．南京林业大学轻工科学与工程学院，江苏南京210037；2．南通市山野实业有限公司，江苏南通226571）摘要：优化了嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus ）木聚糖酶、里氏木霉（Trichoderma reesei ）木聚糖酶和PulpzymeHC 2500木聚糖酶3种木聚糖酶对麦草碱性亚硫酸盐制浆（ASP ）废液的酶解工艺，并比较了它们的酶解特性。

结果表明：嗜碱芽孢杆菌木聚糖酶在酶用量6．0μmol /（mL ·min ）、pH7．0、温度50ħ、时间8h 和废液质量分数50%的条件下，相对多糖水解率为27.7%；里氏木霉木聚糖酶在酶用量10．0μmol /（mL ·min ）、pH5．0、温度50ħ、时间8h 和废液质量分数50%的条件下，相对多糖水解率为48.5%；Pulpzyme HC 2500木聚糖酶在酶用量8．33μmol /（mL ·min ）、pH8．0、温度55ħ、时间4h 和废液质量分数50%的条件下，相对多糖水解率为48.0%。

酶学的研究方法和研究进展酶学是研究酶的性质、结构、功能等方面的一门学科，对于人类的生活和健康具有极为重要的意义。

从化学反应的角度上来看，酶是一种生物催化剂，它可以加速化学反应的速度。

而在生物体内，酶参与了各种代谢的活动，如蛋白质合成、碳水化合物代谢、脂质代谢、核酸代谢等，因此研究酶学对于生命科学的发展、解决疾病问题、提高人类生产力和环保等方面都具有重要作用。

酶的研究方法：1.实验室途径：酶可通过分离纯化、研究其物理化学性质、酶学性质和结构等方面的实验来进行研究。

2.分子遗传学途径：通过研究酶的分子遗传学变异及其遗传修饰来研究酶的构造、功能和协同作用等。

3.系统生物学途径：利用计算生物学、系统生物学等方法，研究酶的代谢通路、蛋白质网络及其调控等。

酶学研究方法中，最常用的是实验室途径。

而分离纯化是实验室中最基础的研究方法，它可通过生物分离、离心、过滤、凝胶过滤、离子交换和亲和层析等方法进行纯化。

实验室中研究酶的物理和化学性质包括：酶的分子量、热稳定性、电泳特征、光谱特征等。

当然，研究酶的酶学性质更是酶学的重要内容，它包括了酶最适条件的确定、酶的反应动力学及其机理、酶的抑制和激活机制等。

而对于酶的结构，分子遗传学及X射线晶体学等方法也十分有效。

酶学的研究进展：1.结构生物学酶的结构生物学研究是酶学发展的一个重要方向，在新的微笑技术和新的结晶方法的加入下，解析酶分子晶体的速度越来越快。

同时，新的分子生物技术方法也为酶结构的研究提供了新突破口。

2.计算酶学计算酶学是把计算科学与酶学研究相结合的一门学科。

随着计算机运算能力的提高，计算酶学成为酶学研究的新的方法和工具。

在酶的分子模拟、酶结构的预测、生物信息学和系统生物学的研究中都有着广泛的应用。

3.酶催化机理研究酶催化机理研究是酶学研究的重要方向之一。

通过酶的特殊构象和活性位点的解析，分析和建立酶催化的反应机理，可以为酶催化机理的解析提供解决问题的方法。

同时，酶催化机理的研究也可以为酶的分子设计、酶抑制剂和活化剂的研究提供思路和方法。

植物乳杆菌降解亚硝酸盐及其亚硝酸盐还原酶的研究凌洁玉;陈旭;陈思羽;金翩翩【摘要】对一株分离自泡菜的植物乳杆菌进行了亚硝酸盐降解的相关研究.首先研究了培养条件对植物乳杆菌降解亚硝酸盐的影响,结果表明:该菌降解亚硝酸盐的最适培养温度为30 ℃,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为酵母抽提物,而在MRS培养基中降解亚硝酸盐能力最强.随后对该菌的亚硝酸盐还原酶进行了提取纯化和酶学性质研究,结果表明:该植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶可能为细胞色素cdI型,分子量大小约为123.2 kDa;其最适反应温度为35 ℃,最适pH值为6.5,Km值为30.0 mmol/L;Cu2+和Mn2+为该酶的激活剂,而Zn2+,K+,EDTA为该酶的抑制剂.%The research on nitrite degradation of a strain of L.plantarum isolated from kimchi is carried out.Firstly, the culture conditions for nitrite degradation are studied.The results show that the optimum culture temperature for nitrite degradation is 30 ℃, the optimum carbon source is glucose and the optimum nitrogen source is yeast extract, and it shows the strongest ability to nitrite degradation in MRS medium.Subsequently, the nitrite reductase is extracted and purified.The results show that the nitrite reductase of L.plantarum may be cytochrome cdI type with the molecular weight of about 123.2 kDa.The optimum reaction temperature is 35 ℃, the optimum pH value is 6.5 and the Km value is 30.0 mmol/L.Cu2+ andMn2+ are activators, and Zn2+, K+ and EDTA are inhibitors for the nitrite reductase.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2017(042)007【总页数】5页(P72-75,89)【关键词】植物乳杆菌;亚硝酸盐降解;亚硝酸盐还原酶【作者】凌洁玉;陈旭;陈思羽;金翩翩【作者单位】武汉设计工程学院食品与生物科技学院,武汉 430205;武汉设计工程学院食品与生物科技学院,武汉 430205;武汉阿楚食品有限公司,武汉 430040;武汉斯隆电气有限公司,武汉 430205【正文语种】中文【中图分类】TS202.3蔬菜在腌制过程中产生的亚硝酸盐一直备受关注，而众多研究表明：腌制过程中参与发酵的许多乳酸菌，具有降解亚硝酸盐的功能[1]。

微生物酶的分离纯化与酶学性质研究微生物酶在生物工程和生物技术领域具有广泛的应用，如食品工业、医药工业和环境工程等。

为了更好地利用微生物酶的功能，研究人员常常需要对微生物中的酶进行分离纯化和酶学性质的研究。

本文将介绍微生物酶的分离纯化方法和酶学性质的研究内容。

一、微生物酶的分离纯化方法微生物酶的分离纯化是指将微生物中的酶从其他组分中分离出来，并获得高纯度的酶样品的过程。

一般而言，微生物酶的分离纯化可以分为以下几个步骤：1. 细胞破碎：首先需要将微生物细胞破碎释放酶。

常见的破碎方法有超声波破碎、高压破碎和球磨破碎等。

2. 细胞层析：通过柱层析技术，可以将酶从细胞裂解液中进一步分离纯化。

常用的柱层析方法有凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。

3. 酶活测定：利用酶活测定方法可以确定酶的纯度和活力。

常用的酶活测定方法有酶促反应法、比色法和荧光法等。

二、微生物酶的酶学性质研究微生物酶的酶学性质研究是指对酶的催化活性、底物特异性、酶动力学参数和酶稳定性等进行研究。

这些研究可以为酶的应用提供理论依据。

1. 催化活性：通过测定酶在不同底物浓度和温度条件下的催化活性，可以确定酶的最适pH值和最适温度等。

2. 底物特异性：通过测试酶对不同底物的催化活性，可以确定酶对底物的特异性。

常用的方法有比色法、荧光法和质谱法等。

3. 酶动力学参数：通过测定酶在不同底物浓度下的催化速率，可以确定酶的酶动力学参数，如酶的最大催化速率和米氏常数等。

4. 酶稳定性：通过测定酶在不同pH值、温度和离子浓度等条件下的稳定性，可以确定酶的稳定性。

常用的方法有热失活曲线法、酶活测定法和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

结论微生物酶的分离纯化和酶学性质研究对于更好地利用酶的功能具有重要的意义。

通过适当的分离纯化方法可以获得高纯度的酶样品，而通过酶学性质的研究可以了解酶催化活性和特性，为酶的应用提供理论依据。

深入研究微生物酶的分离纯化和酶学性质，将有助于推动生物工程和生物技术的发展。