蛋白酶活力测定
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蛋白酶活力测定
三、试剂
➢ 10﹪ CL3CCOOH 水溶液
➢ 0.55mol/L碳酸钠溶液
➢ 缓冲溶液
➢ 福林试剂
显色剂
一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4] 磷钨酸 H3[P（W3O10）4]
蛋白酶活力测定
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O Na2MoO4·2H2o
H2O 85﹪H3PO4 浓HCL
蛋白酶活力测定
一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项
蛋白酶活力测定
一、概述
1．什么是酶？ 2．影响酶催化反应的
因素 3．什么是酶的活力? 4．测定意义 5. 测定方法
蛋白酶活力测定
生物催化剂
一种酶只作用一种底 物：
淀粉酶：只能催
特殊催化功能的蛋白质
化淀粉水解 → 低聚糖；
柠檬酸:
pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40
蛋白酶活力测定
例子： 2709 0.5%酪蛋白 40℃
10
10min
蛋白酶活力测定
2.显色反应
钼蓝+钨蓝
蓝色物质
福林试剂 + 酪氨酸 OH-
HO — —CH2—CH—COOH 还原性 NH2
蛋白酶活力测定
Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 HCL
Li2SO4 Br2
显色剂
显色剂
亮金黄色
福林试剂→
蛋白酶活力测定
3．朗伯-比尔定律及其应用
E —— 吸光度 A —— 消光值 OD —— 光密度
有色真溶液
E = K·Ｃ·L
入射光强度I0 C
= lg（I0/I）
L
= K′·C
透过光强度I
T = 透光率
I
I0 蛋白酶活力测定
朗伯-比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
OD=K·C[RX]
被测组分的浓度与光密度OD成直线关系
蛋白酶活力测定
温度的影响
OD
T最适
T（℃）
蛋白酶活力测定
3350：T最适 ：45℃-47℃ 40℃以下稳
定
1398：T最适 ：30℃-37℃（pH：6.0-
6.5 ）
T最适 ：40 ℃- 50 ℃（pH：7.0-
7.5 ）
2709：T最适 ：45℃-55℃
稳定。
蛋白酶活力测定
40℃以下
作用时间的影响
糊精、
酶的特性:
蛋白酶：只能催 化蛋白质水解 → 氨
基酸、肽；
（1）作用有专一性、选择性
（2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质
在激烈振荡、加热、 紫外线、X-射线的照 射，重金属盐作用下， 它的二、三结构会发 生改变。而变性，失 去催化能力这种现象
叫做酶的失活
蛋白酶活力测定
底物浓度 pH 温度 时间
表示为：单位/g或单位/ml。通常人
们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为
5万单位，即：50000μg/g =0.05g酪氨酸 /1g酶粉。
生皮蛋白 质
测定意义
胶原蛋白（80%-85%）
弹性蛋白 非胶原蛋白 网硬蛋白
间质蛋白
酶的活力会下降 酶的催化能力强
蛋白酶活力测定
测定方法
乙醇滴定法、甲醛滴定法等 Folin-酚法，紫外分光光度法，残 氮量测定法等等。 Gross法、明胶粘度下降法、凝乳 作用法 酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋 白酶原激活作用的大小来表示。
C0 C≥ C0
白无在温T味色弱最度适，至酸溶黄中
色 于 沉
稀粉碱沫pH、，浓无酸臭， 淀 ，pH几最适乎 不
时间
t0
恒溶温于水水浴，有吸缓湿冲性溶，液干 t= t0
燥时稳定，潮湿时迅速
例子： 537 0.5%酪变蛋质白。 40℃
3.0 10min
例子： 1398 0.5%酪蛋白 40℃
7.5 10min
[X]
OD
OD= K′·C[X]
蛋白酶活力测定
注 意:
①选择λmax
λmax =680nm
②OD值的范围 OD=0.2～0.6 OD=0.43
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度C OD
C1
OD1
C2
OD2
C3
OD3
···
···
Cn
ODn
蛋白酶活力测定
福林—酚法测定蛋白酶活力 方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定
蛋白酶活力测定
底wk.baidu.com浓度
V Vmax
底物浓度C C0
饱和浓度
蛋白酶活力测定
溶液pH的影响
OD
pH pH最适
蛋白酶活力测定
酶的分类
❖ 酸性蛋白酶
3350 pH最适=2～4； 7401 ❖ 中性蛋白酶
pH最适=3.0
1398 pH最适=7～7.5； 166 ❖ 碱性蛋白酶
pH最适=7～8
2709 pH最适=9～11； 209 pH最适=9.5～11
蛋白酶活力测定
二、测定原理
福林试剂，在碱性情况下极不 稳定。可被酚类化合物还原， 而呈蓝色反应。由于蛋白质或 水解产物中含有酚基的氨基酸 (酪氨酸、色氨酸等)也呈这个 反应，因此可以利用这个原理 来测定蛋白酶活性的强弱。
蛋白酶活力测定
1．酶催化反应
酶催化
酪蛋白
酪氨酸
条件
条件： 选择： 措施：
底物浓度
条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定 光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配
成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温 度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋 酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移 取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入福 林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较， 计算出被测酶制剂的活力。
Q（反应物的消A 耗量或dQ生成物K 的生成量)
dt dQ
v dt
o
t0
t
蛋白酶活力测定
结论
酶催化反应 在反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较
蛋白酶活力测定
蛋白酶的活力定义：
在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶
液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白） 所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。
CH2—COOH HO—C —COOH
CH2—COOH
B液：0.1mol/L柠檬酸纳 29.4g Na3C6H5O7·2H2O → 1000ml
用时：A∶B=18.6∶1.4混合
蛋白酶活力测定
柠檬酸—柠檬酸钠溶液的pH计算
弱酸—弱酸盐缓冲体系
pH = pka1+lg（C酸/C盐） = 3.13+ lg（C酸/C盐）
100g 25g 100ml 50ml 100ml
Li2 SO4 50g 回流 10hr +
Δ
H2O 50ml
混匀 + 溴水 Δ 15` 冷却 →黄色 → 过滤
金黄色溶液
蛋白酶活力测定
(1)柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0
A液：0.1mol/L柠檬酸 21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml
三、试剂
➢ 10﹪ CL3CCOOH 水溶液
➢ 0.55mol/L碳酸钠溶液
➢ 缓冲溶液
➢ 福林试剂
显色剂
一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4] 磷钨酸 H3[P（W3O10）4]
蛋白酶活力测定
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O Na2MoO4·2H2o
H2O 85﹪H3PO4 浓HCL
蛋白酶活力测定
一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项
蛋白酶活力测定
一、概述
1．什么是酶？ 2．影响酶催化反应的
因素 3．什么是酶的活力? 4．测定意义 5. 测定方法
蛋白酶活力测定
生物催化剂
一种酶只作用一种底 物：
淀粉酶：只能催
特殊催化功能的蛋白质
化淀粉水解 → 低聚糖；
柠檬酸:
pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40
蛋白酶活力测定
例子： 2709 0.5%酪蛋白 40℃
10
10min
蛋白酶活力测定
2.显色反应
钼蓝+钨蓝
蓝色物质
福林试剂 + 酪氨酸 OH-
HO — —CH2—CH—COOH 还原性 NH2
蛋白酶活力测定
Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 HCL
Li2SO4 Br2
显色剂
显色剂
亮金黄色
福林试剂→
蛋白酶活力测定
3．朗伯-比尔定律及其应用
E —— 吸光度 A —— 消光值 OD —— 光密度
有色真溶液
E = K·Ｃ·L
入射光强度I0 C
= lg（I0/I）
L
= K′·C
透过光强度I
T = 透光率
I
I0 蛋白酶活力测定
朗伯-比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
OD=K·C[RX]
被测组分的浓度与光密度OD成直线关系
蛋白酶活力测定
温度的影响
OD
T最适
T（℃）
蛋白酶活力测定
3350：T最适 ：45℃-47℃ 40℃以下稳
定
1398：T最适 ：30℃-37℃（pH：6.0-
6.5 ）
T最适 ：40 ℃- 50 ℃（pH：7.0-
7.5 ）
2709：T最适 ：45℃-55℃
稳定。
蛋白酶活力测定
40℃以下
作用时间的影响
糊精、
酶的特性:
蛋白酶：只能催 化蛋白质水解 → 氨
基酸、肽；
（1）作用有专一性、选择性
（2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质
在激烈振荡、加热、 紫外线、X-射线的照 射，重金属盐作用下， 它的二、三结构会发 生改变。而变性，失 去催化能力这种现象
叫做酶的失活
蛋白酶活力测定
底物浓度 pH 温度 时间
表示为：单位/g或单位/ml。通常人
们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为
5万单位，即：50000μg/g =0.05g酪氨酸 /1g酶粉。
生皮蛋白 质
测定意义
胶原蛋白（80%-85%）
弹性蛋白 非胶原蛋白 网硬蛋白
间质蛋白
酶的活力会下降 酶的催化能力强
蛋白酶活力测定
测定方法
乙醇滴定法、甲醛滴定法等 Folin-酚法，紫外分光光度法，残 氮量测定法等等。 Gross法、明胶粘度下降法、凝乳 作用法 酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋 白酶原激活作用的大小来表示。
C0 C≥ C0
白无在温T味色弱最度适，至酸溶黄中
色 于 沉
稀粉碱沫pH、，浓无酸臭， 淀 ，pH几最适乎 不
时间
t0
恒溶温于水水浴，有吸缓湿冲性溶，液干 t= t0
燥时稳定，潮湿时迅速
例子： 537 0.5%酪变蛋质白。 40℃
3.0 10min
例子： 1398 0.5%酪蛋白 40℃
7.5 10min
[X]
OD
OD= K′·C[X]
蛋白酶活力测定
注 意:
①选择λmax
λmax =680nm
②OD值的范围 OD=0.2～0.6 OD=0.43
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度C OD
C1
OD1
C2
OD2
C3
OD3
···
···
Cn
ODn
蛋白酶活力测定
福林—酚法测定蛋白酶活力 方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定
蛋白酶活力测定
底wk.baidu.com浓度
V Vmax
底物浓度C C0
饱和浓度
蛋白酶活力测定
溶液pH的影响
OD
pH pH最适
蛋白酶活力测定
酶的分类
❖ 酸性蛋白酶
3350 pH最适=2～4； 7401 ❖ 中性蛋白酶
pH最适=3.0
1398 pH最适=7～7.5； 166 ❖ 碱性蛋白酶
pH最适=7～8
2709 pH最适=9～11； 209 pH最适=9.5～11
蛋白酶活力测定
二、测定原理
福林试剂，在碱性情况下极不 稳定。可被酚类化合物还原， 而呈蓝色反应。由于蛋白质或 水解产物中含有酚基的氨基酸 (酪氨酸、色氨酸等)也呈这个 反应，因此可以利用这个原理 来测定蛋白酶活性的强弱。
蛋白酶活力测定
1．酶催化反应
酶催化
酪蛋白
酪氨酸
条件
条件： 选择： 措施：
底物浓度
条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定 光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配
成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温 度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋 酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移 取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入福 林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较， 计算出被测酶制剂的活力。
Q（反应物的消A 耗量或dQ生成物K 的生成量)
dt dQ
v dt
o
t0
t
蛋白酶活力测定
结论
酶催化反应 在反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较
蛋白酶活力测定
蛋白酶的活力定义：
在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶
液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白） 所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。
CH2—COOH HO—C —COOH
CH2—COOH
B液：0.1mol/L柠檬酸纳 29.4g Na3C6H5O7·2H2O → 1000ml
用时：A∶B=18.6∶1.4混合
蛋白酶活力测定
柠檬酸—柠檬酸钠溶液的pH计算
弱酸—弱酸盐缓冲体系
pH = pka1+lg（C酸/C盐） = 3.13+ lg（C酸/C盐）
100g 25g 100ml 50ml 100ml
Li2 SO4 50g 回流 10hr +
Δ
H2O 50ml
混匀 + 溴水 Δ 15` 冷却 →黄色 → 过滤
金黄色溶液
蛋白酶活力测定
(1)柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0
A液：0.1mol/L柠檬酸 21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml