细菌形态观察

常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性 复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌 所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红 等酸性染料染色。
实验原理2
显微镜的构造
1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光 圈、 反光镜等)。它使检视 物放大,生成物象。
思考题
1、制备细菌染色标本时应注意哪些环节？ 2、涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样样？ 3、 为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？
实验五、革兰氏染色
1、学习细菌的革兰氏染色原理和方法 2、了解细菌的特殊形态结构：芽孢、荚膜、鞭毛的染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它 的特殊构造等。
5、水洗
倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂 片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。
Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻 片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
操作步骤（continued） 6、干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最 后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油 镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片 或损伤镜面。
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座， 不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉 菌而腐蚀镜片。
实验材料
1、菌种
Staphylococeus aureus； Escherichia coli； Bacillus subtilis; Corynebacterium pekinese
2、染色剂 草酸铵结晶紫染液
3、其它
四、实验步骤
涂片 干燥 固定
无菌操作
镜检 干燥
染色
水洗
操作步骤
操作步骤（continued）
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
1、涂片
操作步骤（continued）
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取） 生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无 菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑 取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、 物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件.它起着支持 调节 固定 等作用.
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放 大倍数
2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析 两点之间距离的能力。可用公式表 示为：
浸没油与玻璃的折射率相近
很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
根据公式D=λ/2n·sin(α/2 ) ，增大分母，使得D值
减小，分辨率增大。
显微镜保养和使用中的注意事
项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以 保证光洁度
G＋细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留 初染时的紫色。
芽孢染色原理
实验材料
S.aureus；E.coli；Bacillus subtilis; Corynebacterium pekinese （24h培养物）
革兰氏染色液一套
实验步骤
7、镜检（continued）
操作步骤（continued）
Notes:
1) 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油
2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净， 否则可能损害镜头
3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去 镜头上的香柏油 B）沾少许二甲苯滴在另一片擦 镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去 镜头上可能残留的二甲苯。
革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢染色 绘图、写实验报告
革兰氏染色的步骤
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立 即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染3－ 5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
实验三 细菌的简单染色； 油浸镜的使用
实验目的
1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌 的简单染色法。 2、初步认识细菌的形态特征。 3、学习训练无菌操作技术。 4、学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使 用技术及维护的基本知识。
实验原理1
简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的 一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的 观察。
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
Figure 2 - Gram stain of Gram –
E. coli cells
3 枯草杆菌芽孢的染色
1、制备菌液：加2-4滴蒸馏水于小试管中，用 接种环从斜面挑取菌体2环于试管中充分混匀。 2、加染色液：加孔雀绿3滴于小试管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一 干净载玻片上，制成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。 7、复染：加复红染色1-2分钟。水洗，吸水纸 吸干。 ８、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染 色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别 染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 荚膜染色法等。
细菌细胞壁的结构
革兰氏染色的实验原理
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质，增 加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。
4细菌荚膜的染色
负染色法： 1、制片：取洁净的载玻
片一块，加一滴黑墨水， 取少量的菌体放入墨水滴 中混匀并涂片。
2、刮片：另取一载玻片， 以三十度角将其边缘浸入 黑素中向右端拖动，将黑 素涂成一薄层。
3、镜检：10x ，40x 物 镜观察（注意物镜不要接 触黑素，不要用油镜观察）
荚膜
实验报告
1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。 2 记录所观察到的染色结果，并ห้องสมุดไป่ตู้图
请确保油镜头擦拭干净！ 请第二组同学留下值日 下周再见！
D=λ/2n· sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最 短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
油镜使用的原理
油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时， 由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射， 降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率 与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光 量，从而使物象更加清晰。
2、思考题
1）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？
2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？
3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？ 4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？
哪一步是关键？Why?
本次实验课结束
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、 碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷， 而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正 电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌 结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景 形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
实验原理 (continued)
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌 体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察 到其形态和结构。
3）改变菌体对染液的通透性，一般死细胞原生质易着色。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态
4、染色
操作步骤（continued）
◇ 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上 （染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。
◇ 草酸铵结晶紫染色1-2min。
如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2 环直接涂于载玻片上。
Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取 菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2、干燥 室温自然干燥
操作步骤（continued）
3、固定 固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。