荧光定量PCR实验指南（一）
一、基本步骤：
1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；
2、引物、探针的设计；
3、引物探针的合成；
4、反应体系的配制；
5、反应条件的设定；
6、反应体系和条件的优化；
7、荧光曲线和数据分析；
8、标准品的制备；
二、技术关键：
1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；
从/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。
2、引物和探针设计
2.1引物设计
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
序列选取应在基因的保守区段；
扩增片段长度根据技术的不同有所分别：
sybr green I技术对片段长度没有特殊要求；
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
避免引物自身形成环状发卡结构；
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
引物之间的TM相差避免超过2℃；
引物的3’端避免使用碱基A；
引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
2.2 T aqman 探针设计一般设计原则：
探针位置尽可能地靠近上游引物；
探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
探针的5’端应避免使用碱基G。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(/BLAST)
2.3 T aqman MGB 探针设计介绍
MGB探针的优点：
MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
短片段探针(14-20bp)加上MGB后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。
MGB探针的设计原则
探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。
尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
2.4 实时多重PCR探针的选择：
多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。
在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:
设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出
