高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定

天津科技大学生物化学实验报告专业：班级：姓名学号组别第组实验项目同组人完成时间年月日【实验名称】《垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质》【实验目的】学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

【实验原理】蛋白质的性质：三种物理效应：、、。

1、2、3、成绩：教师签字：批阅日期：聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续：、、、。

1、2、3、4、蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(10-b·m)logMr=LogK—b·Rm式中Mr——蛋白质的分子量；logK——截距；b——斜率；Rm——相对迁移率。

实验证明，蛋白质分子量在15,000～200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。

蛋白质的相对迁移率Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。

这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。

【材料与设备】1.仪器设备DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂),电泳仪,微量移液器2.材料烧杯(250mL、500mL)、量筒(500mL、250mL)、培养皿3.主要试剂（1）标准蛋白混合液：内含磷酸化酶(Mw94,000)，牛血清蛋白(Mw67,000)，肌动蛋白(Mw43,000)，磷酸酐酶(Mw30,000)和溶菌酶(Mw14,000)（2）30％凝胶贮备液：Acr30g，Bis0.8g,加蒸馏水至100mL（3）分离胶缓冲液(1.5mol／L):Tris18.15g,加水溶解,6mol/L HCl调pH8.9,定容100mL（4）浓缩胶缓冲液(0.5mol／L):Tris6g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL（5）5×电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris6g，Gly28.8g，加水溶解并定容到1000mL。

蛋白质分子量测定实验报告实验报告：蛋白质分子量测定一、实验目的1.掌握蛋白质分子量测定的基本原理和方法。

2.学习使用SDS-PAGE电泳技术测定蛋白质分子量。

3.了解蛋白质的基本性质和分子结构。

二、实验原理蛋白质分子量测定是蛋白质研究中的基本操作之一。

通过测定蛋白质的分子量，可以了解蛋白质的结构、功能和分类等信息。

常用的蛋白质分子量测定方法有SDS-PAGE电泳、渗透压法、凝胶色谱法等。

本实验采用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量。

SDS-PAGE电泳法是一种基于电泳分离和分子筛作用的蛋白质分离技术。

在SDS-PAGE电泳中，样品蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，然后在电场作用下迁移。

由于SDS的分子量已知，因此根据迁移率和分子量的关系，可以通过计算得出蛋白质的分子量。

三、实验步骤1.准备试剂和仪器（1）试剂：蛋白质样品、SDS、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、甘氨酸碱溶液、冰醋酸、超纯水。

（2）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、摇床、离心管、移液器、计时器、分光光度计。

2.样品制备（1）将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）稀释至一定浓度。

（2）加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，搅拌均匀。

（3）煮沸5-10分钟，使蛋白质变性并充分与SDS结合。

（4）离心10分钟，取上清液备用。

3.电泳分离（1）按照电泳仪使用说明书，装配垂直板电泳槽，加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。

（2）将制备好的样品加入电泳槽中，注意不要产生气泡。

（3）接通电泳电源，调节电压为100V，开始电泳分离。

（4）电泳过程中保持温度恒定，并及时补充水以保持电泳槽中的水平。

（5）当样品迁移至距底部约1cm时，停止电泳。

4.染色与脱色（1）将凝胶取出，用自来水冲洗干净。

（2）加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下染色30分钟。

（3）加入脱色液，室温下脱色至背景清晰。

一、实验背景蛋白质是生物体内的重要功能分子，具有多种生物学功能，如催化、结构、运输、信号传导等。

因此，蛋白质定量分析在生物科学研究中具有重要意义。

本实验旨在通过双缩脲法对蛋白质进行定量测定，并分析实验结果。

二、实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；2. 学会操作双缩脲试剂，并观察蛋白质定量结果；3. 分析实验数据，探讨蛋白质定量结果的影响因素。

三、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理是：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）发生反应，生成紫红色的络合物。

该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，通过测定吸光度可以计算出蛋白质的浓度。

四、实验材料1. 实验试剂：- 双缩脲试剂A：0.1g/L硫酸铜溶液；- 双缩脲试剂B：0.01g/L酒石酸钾钠溶液；- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）；- 未知蛋白质样品；- 蒸馏水；- 6mol/L氢氧化钠溶液；- 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。

2. 实验仪器：- 分光光度计；- 移液器；- 试管；- 烧杯；- 玻璃棒。

五、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 加入0.2mL双缩脲试剂A；- 混匀，静置10分钟；- 加入0.4mL双缩脲试剂B；- 混匀，静置10分钟；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 测定未知蛋白质样品：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL未知蛋白质样品； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 按照步骤1中的方法进行操作；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 通过标准曲线计算未知蛋白质样品的浓度。

六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R2=0.998。

一、实验目的1. 掌握蛋白质定量测定的原理和方法。

2. 学习使用双缩脲试剂法测定蛋白质含量。

3. 了解蛋白质定量测定在生物学研究中的应用。

二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，其含量在生物体中占有重要地位。

蛋白质定量测定是研究蛋白质生物学功能的重要手段。

本实验采用双缩脲试剂法测定蛋白质含量，该法基于蛋白质分子中的肽键与双缩脲试剂发生反应，生成紫红色络合物，通过测定络合物在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准蛋白质溶液- 样品溶液- 双缩脲试剂- 6.0mol/L NaOH 溶液- 水浴锅- 分光光度计- 移液器- 烧杯- 试管2. 实验仪器：- 双缩脲试剂- 6.0mol/L NaOH 溶液- 标准蛋白质溶液- 样品溶液- 水浴锅- 分光光度计- 移液器- 烧杯- 试管四、实验步骤1. 标准曲线的制作：- 将标准蛋白质溶液按照一定的倍数稀释，配制成一系列已知浓度的标准溶液。

- 将标准溶液与双缩脲试剂混合，置于水浴锅中加热反应5分钟。

- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度值。

- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品溶液的测定：- 将样品溶液与双缩脲试剂混合，置于水浴锅中加热反应5分钟。

- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度值。

- 根据标准曲线，计算出样品溶液中蛋白质的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 标准曲线的线性关系良好，相关系数R²大于0.99。

2. 样品溶液的测定：- 样品溶液的蛋白质含量为X g/L。

六、实验讨论1. 实验过程中，双缩脲试剂的配制、加热反应时间、吸光度测定等步骤均需严格控制，以保证实验结果的准确性。

2. 双缩脲试剂法测定蛋白质含量具有较高的灵敏度，但易受到洗涤剂、盐类等物质的干扰。

3. 蛋白质定量测定在生物学研究中具有重要意义，可用于研究蛋白质的生物学功能、蛋白质组学等。

一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。

2. 学习使用分光光度计进行比色分析。

3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。

二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。

该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。

通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。

实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。

该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。

2. 考马斯亮蓝G-250染料。

3. 6.0mol/L NaOH溶液。

4. 双蒸水。

5. 分光光度计。

6. 试管、移液器、吸管等实验器材。

四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。

3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。

2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。

3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。

实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。

六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。

2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。

3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。

4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。

七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。

一、实验名称：蛋白质分子量测定——凝胶层析法二、实验目的：1. 了解凝胶层析法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质的分子量。

3. 培养实验操作技能和数据处理能力。

三、实验原理：凝胶层析法是一种利用凝胶作为固定相，通过分子大小不同的物质在凝胶孔径中的移动速度差异来实现分离的方法。

在凝胶层析中，大分子物质不能进入凝胶内部的孔径，而小分子物质可以进入孔径，从而在洗脱过程中，大分子物质先流出，小分子物质后流出。

通过测量不同分子量蛋白质的洗脱体积，可以计算出其分子量。

四、实验材料与试剂：1. 凝胶层析柱（直径1.5cm，长30cm）2. 凝胶（聚丙烯酰胺凝胶）3. 蛋白质样品（已知分子量）4. 标准样品（已知分子量）5. 洗脱液（Tris-HCl缓冲液）6. 显色剂（考马斯亮蓝G-250）7. 移液器8. 旋转混匀器9. 分光光度计五、实验步骤：1. 准备凝胶层析柱：将凝胶倒入层析柱中，用洗脱液充分浸泡凝胶，直至凝胶膨胀并固定在层析柱中。

2. 准备样品：将蛋白质样品和标准样品分别稀释至适当浓度。

3. 加样：将蛋白质样品和标准样品分别加入凝胶层析柱中，用洗脱液洗脱，收集不同洗脱体积的洗脱液。

4. 显色：将收集到的洗脱液加入考马斯亮蓝G-250显色剂，室温下显色10分钟。

5. 测量：用分光光度计测定显色液在595nm处的吸光度值。

6. 数据处理：以标准样品的分子量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据蛋白质样品的吸光度值，从标准曲线上查得蛋白质的分子量。

六、实验结果：（此处插入实验数据表格，包括标准样品和蛋白质样品的分子量、洗脱体积、吸光度值等）七、实验分析：通过凝胶层析法，成功分离了蛋白质样品，并测定了其分子量。

实验结果表明，蛋白质样品的分子量与标准样品的分子量相符，说明实验操作正确。

八、讨论与心得：1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质分离方法，可用于测定蛋白质的分子量。

2. 在实验过程中，要注意凝胶层析柱的制备、样品的加入和洗脱液的收集等操作步骤，以保证实验结果的准确性。

蛋白分子量测定实验报告蛋白分子量测定实验报告引言：蛋白质是生命体内最重要的分子之一，它们在细胞功能、结构和代谢中发挥着关键作用。

蛋白质的功能与其分子量密切相关，因此准确测定蛋白质的分子量对于研究其功能和结构具有重要意义。

本实验旨在通过几种常用的方法来测定蛋白质的分子量，并对实验结果进行分析和讨论。

材料与方法：1. 蛋白质样品：本实验选取了几种不同分子量的蛋白质标准品作为样品。

2. SDS-PAGE凝胶：使用12%的聚丙烯酰胺凝胶，准备好电泳缓冲液。

3. 蛋白质电泳样品制备：将蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，加热至95°C，然后冷却至室温。

4. 蛋白质电泳：将电泳样品注入凝胶槽中，施加电压使蛋白质样品迁移。

5. Coomassie蓝染色：将凝胶浸泡在Coomassie蓝染色液中，使蛋白质样品显现出带状条纹。

6. 分子量标记物：将已知分子量的蛋白质标记物与样品一起电泳，用于分子量校正。

结果与讨论：通过SDS-PAGE电泳和Coomassie蓝染色，我们观察到了蛋白质样品在凝胶上的迁移和染色结果。

根据迁移距离和分子量标记物的位置，我们可以初步估计样品的分子量。

然而，由于蛋白质的结构和电荷特性的差异，蛋白质在凝胶上的迁移速度可能会受到影响。

因此，为了更准确地测定蛋白质的分子量，我们需要建立一个标准曲线，将迁移距离与已知分子量标记物的分子量进行关联。

在本实验中，我们选取了几种已知分子量的蛋白质标准品作为参照物，测定它们在凝胶上的迁移距离，并绘制标准曲线。

通过线性回归分析，我们可以根据样品的迁移距离在标准曲线上找到对应的分子量。

然而，需要注意的是，标准曲线的制备和分析过程中可能存在误差。

例如，蛋白质的折叠状态、修饰和聚集状态都可能影响其迁移速度。

此外，凝胶的制备和电泳条件的选择也可能对实验结果产生影响。

为了进一步提高测定蛋白质分子量的准确性，我们可以结合其他方法进行验证。

例如，质谱法可以直接测定蛋白质的分子量，具有较高的精确度和灵敏度。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。

若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。

1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。

加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。

同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。

其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。

(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。

不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。

这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。

需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。

因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。

试验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有肯定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。

当混合物随流淌相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分别的技术。

该法设备简洁、操作便利、重复性好、样品回收率高。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状构造、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的微小构造及筛孔的直径均匀全都，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。

当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流淌而发生移动。

大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再集中出来，故流程长，移动速度慢，最终被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分别。

假设分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。

总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和集中的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分别开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt 表示。

实质上Vt 是由Vo，Vi 与Vg 三局部组成，Vo 称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流淌相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。

Vg 为凝胶本身的体积。

洗脱体积〔Ve〕与Vo 与Vi 之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。

式中Ve 为洗脱体积，自参加样品时算起，到组分最大浓度〔峰〕消灭时所流出的体积；Kd 为样品组分在二相间的安排系数，也可以说Kd 是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的安排系数。

它只与被分别的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。

Kd 可通过试验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。

生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。

凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同分子量的物质。

以下进一步来说明凝胶层析的原理。

将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。

实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。

Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。

洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。

蛋白分子量测定实验报告蛋白分子量测定实验报告引言：蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，其分子量的准确测定对于生物学研究以及医学诊断具有重要意义。

本实验旨在通过几种常用的方法，如SDS-PAGE、Western blot以及质谱分析，来测定蛋白质的分子量。

实验方法：1. SDS-PAGE：SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行变性，使其呈线性结构，并在电场作用下按照分子量大小进行迁移。

本实验选取了不同分子量的蛋白标准品，与待测蛋白样品一同加载至凝胶中，经电泳分离后，用Coomassie蓝染色显色。

根据标准品的迁移距离和蛋白样品的迁移距离，可以大致估计待测蛋白的分子量。

2. Western blot：Western blot是一种高灵敏度的蛋白质检测方法，结合了SDS-PAGE和免疫印迹技术。

首先，将蛋白样品经SDS-PAGE分离，然后将其转移到聚丙烯酰胺膜上。

接下来，使用特异性抗体与目标蛋白结合，并用酶标记的二抗进行检测。

最后，通过显色或发光的方式观察目标蛋白的存在与否。

通过与标准品的比对，可以推测待测蛋白的分子量。

3. 质谱分析：质谱分析是一种准确测定蛋白质分子量的方法。

通过将蛋白样品经过电喷雾或激光解离，得到蛋白质的质谱图。

质谱图中的峰值对应着不同的蛋白离子，根据其质荷比可以推测出蛋白质的分子量。

实验结果：在本实验中，我们选取了几种常见的蛋白质作为标准品，包括乳清蛋白、细胞色素C和胰岛素。

通过SDS-PAGE的分离，我们观察到这些标准品在凝胶上呈现出不同的迁移距离。

与标准品相比，待测蛋白样品的迁移距离可以推测出其大致的分子量范围。

通过Western blot的检测，我们成功地检测到了待测蛋白的存在，并与标准品进行了比对。

根据标准品的分子量和待测蛋白的迁移距离，我们可以初步确定了待测蛋白的分子量。

此外，我们还进行了质谱分析，得到了待测蛋白的质谱图。

一、实验目的1. 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法测定蛋白质分子量的原理及操作方法。

2. 通过建立标准曲线，准确测定未知蛋白质样品的分子量。

3. 分析实验结果，验证实验方法的可行性和准确性。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法是一种常用的蛋白质分子量测定方法。

该方法利用SDS（十二烷基磺酸钠）使蛋白质变性，去除蛋白质分子原有的电荷差异，使所有蛋白质分子带有相同的负电荷。

在电场作用下，蛋白质分子按照分子量的大小进行分离，分子量越大，迁移速度越慢。

通过建立标准曲线，可以准确测定未知蛋白质样品的分子量。

三、实验材料1. 未知蛋白质样品2. 标准蛋白质样品（已知分子量）3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶4. 电泳槽5. 电泳仪6. 蛋白质染色剂7. 显微镜四、实验步骤1. 准备SDS-聚丙烯酰胺凝胶：按照实验要求配制凝胶，加入适量的SDS和TEMED，混合均匀后倒入垂直板电泳槽中，待凝胶凝固。

2. 准备样品：将未知蛋白质样品和标准蛋白质样品分别进行SDS处理，加入适量β-巯基乙醇，混匀后煮沸5分钟，使蛋白质变性。

3. 加样：将处理好的样品和标准蛋白质样品分别加入凝胶孔中，注意加样时避免气泡产生。

4. 电泳：将电泳槽充满电泳缓冲液，接通电源，调整电压至100V，进行电泳。

电泳时间根据实验要求确定。

5. 染色：电泳结束后，将凝胶取出，用适当比例的染色剂和脱色剂进行染色和脱色。

6. 分析结果：观察凝胶上的蛋白质条带，记录标准蛋白质样品的分子量，以及未知蛋白质样品的迁移距离。

五、实验结果与分析1. 标准曲线建立：以标准蛋白质样品的分子量为横坐标，其相对迁移率为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 未知蛋白质样品分子量测定：根据未知蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查找对应的分子量。

3. 结果分析：根据实验结果，验证实验方法的可行性和准确性。

如果实验结果与预期相符，则说明实验方法可行。

六、实验讨论1. 实验过程中，SDS处理对蛋白质变性至关重要，应严格控制处理时间，以免影响实验结果。

一、实验目的1. 掌握蛋白质分子量测定方法；2. 学习使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术测定蛋白质分子量；3. 了解蛋白质分子量与生物功能的关系。

二、实验原理蛋白质分子量是衡量蛋白质大小的重要指标，对于蛋白质的结构、功能和生物学活性等研究具有重要意义。

SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分子量测定方法，其原理是将蛋白质样品在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，SDS能够使蛋白质变性，并使其带有负电荷，从而消除蛋白质分子间电荷差异，使蛋白质的迁移率仅与分子量有关。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质样品、SDS-PAGE凝胶制备试剂、电泳缓冲液、染色试剂等；2. 仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、紫外检测仪、凝胶成像系统等。

四、实验步骤1. 准备SDS-PAGE凝胶：按照说明书配制凝胶制备试剂，加入SDS、β-巯基乙醇等，混合均匀后倒入电泳槽，插入梳子，静置至凝胶凝固。

2. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，加入β-巯基乙醇，沸水浴变性5分钟。

3. 加样：将变性后的蛋白质样品加到凝胶样品孔中，加入标准蛋白质分子量标记。

4. 电泳：将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，开启电泳仪，设置电压和电泳时间，待溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，关闭电泳仪。

5. 染色：将凝胶取出，加入染色试剂，染色30分钟。

6. 洗脱：将染色后的凝胶放入脱色液中，脱色30分钟。

7. 成像与分析：使用凝胶成像系统对凝胶进行拍照，分析蛋白质分子量。

五、实验结果与分析1. 实验结果：根据蛋白质样品在凝胶中的迁移距离，可以判断蛋白质分子量大小。

2. 结果分析：根据标准蛋白质分子量标记的迁移距离，绘制标准曲线，根据蛋白质样品的迁移距离，从标准曲线上查找相应的蛋白质分子量。

六、讨论与心得1. 讨论：本实验成功测定了蛋白质分子量，SDS-PAGE技术具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点，是蛋白质分子量测定的常用方法。

一、实验目的1. 掌握蛋白质测定的原理和方法。

2. 熟悉实验操作步骤和注意事项。

3. 通过实验，提高实验技能和数据分析能力。

二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能。

蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、比色法等。

本实验采用双缩脲法测定蛋白质含量。

双缩脲法基于蛋白质分子中的肽键与铜离子反应生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

通过测定该络合物在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质含量。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、牛奶、豆奶等蛋白质样品。

2. 试剂：（1）双缩脲试剂A：称取硫酸铜0.1g，溶解于100ml蒸馏水中。

（2）双缩脲试剂B：称取酒石酸钾钠0.5g，溶解于100ml蒸馏水中，加入10g 氢氧化钠。

（3）标准蛋白质溶液：称取牛血清白蛋白0.1g，溶解于100ml蒸馏水中，配制成1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液。

四、实验仪器1. 电子天平2. 移液器3. 721分光光度计4. 烧杯5. 试管6. 滴管五、实验步骤1. 样品制备：取适量蛋白质样品，加入蒸馏水稀释至一定浓度。

2. 标准曲线绘制：分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液于试管中，加入2ml双缩脲试剂A，摇匀，静置2min。

然后加入2ml双缩脲试剂B，摇匀，静置2min。

以蒸馏水为空白，于540nm波长下测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：分别取0.2ml样品溶液于试管中，按照步骤2的操作进行测定。

以蒸馏水为空白，于540nm波长下测定吸光度。

4. 结果计算：根据标准曲线，计算样品中蛋白质含量。

六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线，计算相关系数R²，验证标准曲线的线性关系。

2. 样品测定：根据标准曲线，计算样品中蛋白质含量，并与理论值进行比较。

一、实验目的1. 掌握蛋白质的测定原理和方法；2. 学会使用双缩脲试剂和凯氏定氮法测定蛋白质含量；3. 了解蛋白质在生物体中的重要作用。

二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，是生物体的重要组成部分。

蛋白质的测定方法有很多，本实验主要介绍双缩脲试剂法和凯氏定氮法。

1. 双缩脲试剂法：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子反应，生成紫红色络合物。

根据络合物颜色的深浅，可以测定蛋白质的含量。

2. 凯氏定氮法：蛋白质分子中的氮含量相对稳定，约为16%。

通过测定样品中的氮含量，可以计算出蛋白质的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、双缩脲试剂、凯氏定氮试剂、蒸馏水、滴定管、试管、烧杯、电炉、天平等。

2. 仪器：双缩脲比色计、凯氏定氮仪、分析天平、移液管、滴定管、酒精灯等。

四、实验步骤1. 双缩脲试剂法测定蛋白质含量（1）取一定量的鸡蛋清溶液，加入双缩脲试剂，观察颜色变化。

（2）用双缩脲比色计测定吸光度。

（3）根据标准曲线计算蛋白质含量。

2. 凯氏定氮法测定蛋白质含量（1）取一定量的鸡蛋清溶液，加入硫酸铵和氯化钠，混匀。

（2）将混合液转移到凯氏烧瓶中，加入硫酸和硫酸铜，加热消化。

（3）将消化液转移到蒸馏瓶中，加入过氧化氢和氢氧化钠，进行蒸馏。

（4）收集蒸馏液，用滴定管滴定剩余的酸液。

（5）根据滴定结果计算氮含量，进而计算出蛋白质含量。

五、实验结果与分析1. 双缩脲试剂法测定蛋白质含量通过双缩脲比色计测定吸光度，得到蛋白质含量为x g/L。

2. 凯氏定氮法测定蛋白质含量通过滴定计算，得到氮含量为y g/L，进而计算出蛋白质含量为z g/L。

六、实验结论1. 通过双缩脲试剂法和凯氏定氮法，可以测定蛋白质含量。

2. 蛋白质在生物体中具有重要作用，是生命活动的基础。

3. 本实验操作简便，结果可靠，为蛋白质的测定提供了有效方法。

七、注意事项1. 在进行双缩脲试剂法测定时，应确保试剂的准确性，避免误差。

实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。

（2）学习用标准蛋白质混合液制作V e，K av对1gM r的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。

二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。

凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

分离过程中的示意见图17-1。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同分子量的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t（total volume）表示。

一、实验目的1. 熟悉蛋白质含量测定的原理和方法；2. 掌握双缩脲法和凯氏定氮法测定蛋白质含量的操作步骤；3. 了解不同方法测定蛋白质含量的优缺点；4. 培养实验操作能力和数据处理能力。

二、实验原理1. 双缩脲法：蛋白质分子中含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），在碱性溶液中能与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。

这种紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量在一定范围内呈正比关系。

2. 凯氏定氮法：蛋白质中的氮含量相对稳定，约为16%左右。

通过凯氏定氮法测定样品中的氮含量，再乘以 6.25，即可得到蛋白质含量。

该方法包括样品的消化、蒸馏、滴定等步骤。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、牛肉、花生、大豆、玉米粉等蛋白质样品；标准蛋白质溶液；NaOH溶液；双缩脲试剂；凯氏定氮试剂等。

2. 实验仪器：分光光度计、电子天平、移液器、试管、锥形瓶、凯氏烧瓶、电炉、蒸馏装置、滴定管等。

四、实验步骤1. 双缩脲法（1）配制标准蛋白质溶液：准确称取一定量的标准蛋白质，用蒸馏水溶解并定容至100ml，得到浓度为1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）制备样品溶液：准确称取一定量的蛋白质样品，用蒸馏水溶解并定容至10ml，得到浓度为0.1mg/ml的样品溶液。

（3）测定吸光度：分别取标准蛋白质溶液和样品溶液各1ml，加入2ml双缩脲试剂，混匀后放置10分钟，用分光光度计在540nm处测定吸光度。

2. 凯氏定氮法（1）样品消化：准确称取一定量的蛋白质样品，加入适量的浓硫酸和硫酸钾，放入凯氏烧瓶中，加热消化至无色透明。

（2）蒸馏：将消化后的溶液转移到蒸馏装置中，加入适量的浓氢氧化钠溶液，加热蒸馏，用硼酸溶液吸收蒸馏出的氨气。

（3）滴定：待吸收完全后，用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点，记录消耗的盐酸体积。

生化蛋白质实验报告生化蛋白质实验报告引言：蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。

生化蛋白质实验旨在研究蛋白质的组成、结构和功能，以及它们在生物体内的相互作用。

本实验通过一系列的步骤来分离和纯化蛋白质，并对其进行进一步的分析和鉴定。

实验材料与方法：1. 细胞培养：使用细胞培养技术培养目标蛋白质所在的细胞系，确保细胞处于健康生长的状态。

2. 细胞裂解：通过加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。

3. 蛋白质分离：利用离心技术将裂解液中的细胞碎片与蛋白质分离。

4. 蛋白质纯化：采用色谱层析技术，如亲和层析、离子交换层析等，将目标蛋白质从其他蛋白质中纯化出来。

5. 蛋白质分析：利用凝胶电泳技术对纯化后的蛋白质进行分析，如SDS-PAGE、Western blot等。

实验结果与讨论：通过以上步骤，我们成功地从细胞中提取并纯化出目标蛋白质。

在SDS-PAGE凝胶电泳中，我们观察到了明显的蛋白质带，表明纯化过程取得了一定的成功。

进一步的Western blot实验结果显示，目标蛋白质在细胞系中的表达水平较高，并且具有较好的免疫原性。

在蛋白质组成分析方面，我们使用质谱技术对纯化后的蛋白质进行了鉴定。

质谱分析结果显示，目标蛋白质的分子量约为50 kDa，与文献报道的相符。

此外，通过质谱分析还发现了一些可能是目标蛋白质的修饰，如磷酸化、甲基化等，这些修饰对蛋白质的功能和调控具有重要的影响。

蛋白质结构是了解其功能和相互作用的关键。

在实验中，我们采用了X射线晶体学技术对目标蛋白质的结构进行了解析。

通过解析蛋白质的晶体结构，我们可以观察到其二级结构、立体构型以及可能的结合位点。

这些结构信息为我们进一步研究蛋白质的功能和相互作用提供了重要的线索。

结论：通过本次生化蛋白质实验，我们成功地从细胞中提取、纯化并鉴定了目标蛋白质。

通过分析其组成、结构和功能，我们对该蛋白质的特性有了更深入的了解。