乳酸菌得分离培养
保加利亚乳杆菌
组长：
组员：
实验目得：1、学习并掌握普通光学显微镜油镜得使用技术及微生物形态观察；
2、学习微生物制片、染色得基本技术，掌握乳酸菌得简单染色法及无菌操作接种技术；
3、通过对培养基得配制，了解配制培养基得一般步骤与方法，掌握微生物实验常用得器皿得清洗与包扎、培养基得制备、消毒灭菌。
4、了解各种灭菌得基本原理与应用范围，以及实验室中常用得灭菌方法。
5、了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌得基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目得测定得方法。
6、了解稀释平板计数得原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数得原理并学习使用血球计数板进行微生物计数得方法。
7．初步学会乳酸菌培养得基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应得原理与方法，掌握进行微生物大分子水解试验得原理与方法。
8、了解并掌握微生物菌种保藏得常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同得生物大分子得分解利用情况，认识微生物代谢类型得多样性。
实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸得一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌得总称，本实验中
用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法就是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+与G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌与乳球菌得混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售得酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物得大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基就是按照微生物生长发育得需要，用不同组份得营养物质调制而成得营养基质；灭菌就是用物理或化学得方法来杀死或除去物品上或环境中得所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往就是不同种类微生物得混合体，为了研究某种微生物得特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂得微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养得方法称为微生物得分离与纯化。用生化试验得方法检测细菌对各种基质得代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌得种属，称之为细菌得生化反应。
实验器材：
样品：含乳酸菌得酸奶
①培养基：改良MRS固体培养基
蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物2、5g 柠檬酸二铵1g 水500mL
乙酸钠2、5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0、125 吐温80 0、5mL
琼脂12、5g MgSO4·7H2O 0、29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。
仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个
250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只
15ml试管7只高压灭菌锅天平
水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺
电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺
牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片
酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计数板
载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸、吸水纸
液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯
火柴、滴管
药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。
药品配制
结晶紫：结晶紫乙醇饱与液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。将两液混匀即成。
卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。
蕃红溶液：番红2、5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。
0、1%得吕氏美蓝染液：A液：美蓝0、3g，95%乙醇300ml；B液：0、01% KOH 100ml。混合A与B 液即成，按1：100稀释即可。
生理盐水：称取0、9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
实验步骤：
一、培养基得培养
1．称量用天平称取蛋白胨1g, 牛肉膏1g , 酵母提取物0、5g ,柠檬酸二铵0、2g,乙酸钠0、5g , K2HPO4 0、2g, MnSO4·4H2O 0、025g, MgSO4·7H2O 0、06g , 葡萄糖2g , 吐温80 0、1mL , CaCO3 1g放入烧杯。
2．溶解向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热,在石棉网上加热溶解后,加入2、5g琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化得过程中，要控制火力得大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。
3．调节pH 用滴管逐滴滴入1mol/L得NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密得pH试纸测pH，直到pH到6、8左右。
4．过滤要趁热用四层纱布过滤
5．培养基得分装将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。注意：分装时不要将培养基沾在管口与试管上段，以免引起污染。
6．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度得2/3在试管口内。
7．包扎在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期与制作者姓名
二、灭菌
1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面得灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。
2．将扎好得试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。（注意：灭菌桶内得物品不能放得
太挤，否则会影响灭菌效果）。
3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶得排气槽内。（以两两对称得方式，同时旋紧相对得两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方得安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内得冷空气。
4．设置灭菌温度与时间。温度为121℃,20分钟灭菌
5．排出锅内得冷空气，关上排气阀，让锅内得温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内得压力上升到98kPa 时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min。
6．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表得压力将至0时，打开排气阀，旋开盖子，取出灭菌物品。
三、无菌检查
将取出得灭菌培养基放入37℃温箱保温培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
四、菌悬液得配制
先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水得三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇20分钟，使样品均匀分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml酸奶悬液注入9ml无菌水得试管中，吹息三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水得试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度得菌悬液（要取7只15ml试管）。
五、倒平板
取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒得培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。
六、分离方法
A．涂布平板法
用三支1ml无菌吸管分别吸取10-5、10-6与10-7得稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应得3个无菌平板中，每个平皿放0、2ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放与试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
B．平板划线
1、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，按无菌操作对标有‘10-1‘得3个平板进行划操作。
常用得划线方法有;(a)用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基得一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线与通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。（b）将挑取有样品得接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
C．稀释混合平板法
先分别吸取1ml得10-5、10-6、10-7稀释度得菌悬液对号放入平板中，然后再倒入经高温消毒得并冷却到50℃左右培养基中，边倒入边摇匀，使样品中得微生物与培养基混合均匀，到冷凝成平板后，倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
七、菌落特征得观察
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好得平板，先对其菌落形态（如菌落得大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、就是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌得菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3得溶解圈。
八、乳酸菌得形态观察及保加利亚乳杆菌得形态观察
（一）普通光学显微镜得使用
