小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离

分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法小鼠骨髓免疫细胞分离骨髓是造血的场所，含有各种类型的免疫细胞，包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和髓系干细胞。

分离这些细胞对于研究免疫系统、干细胞生物学和疾病机制至关重要。

以下是分离小鼠骨髓中免疫细胞的详细方法：材料：小鼠PBS（pH 7.2-7.4）细胞培养液（例如 RPMI 1640）琼脂糖琼脂（0.5% w/v）40 µm细胞过滤器50 mL离心管移液器台式离心机步骤：1. 屠宰小鼠：使用二氧化碳或异氟烷麻醉小鼠，然后通过颈椎脱臼法将其屠宰。

2. 取出股骨：将小鼠固定在工作台上，用无菌镊子和剪刀小心取出股骨。

3. 暴露骨髓：使用无菌剪刀剪开股骨两端，用 PBS 冲洗髓腔，将骨髓液冲入一个 50 mL 离心管中。

4. 过滤细胞：用 40 µm 细胞过滤器将骨髓液过滤到另一个50 mL 离心管中。

5. 离心细胞：以300 × g 的速度离心 10 分钟，除去沉淀的骨骼碎片和未裂解的细胞。

6. 收集沉淀：小心地吸出上清液，并收集沉淀的细胞。

7. 再悬浮细胞：用细胞培养液将细胞重悬浮，调整细胞密度至1-2 × 10^6 个细胞/mL。

免疫细胞的分离：分离免疫细胞需要专用的抗体和磁珠。

不同的抗体靶向不同的细胞表面标志物，使特定细胞类型与磁珠结合。

磁珠与细胞的结合强度取决于抗体的亲和力和细胞表面标志物的表达水平。

1. 抗体标记：向细胞悬液中加入抗体，孵育 30 分钟，4°C。

2. 磁珠孵育：加入与抗体匹配的磁珠，孵育 15 分钟，4°C。

3. 磁分离：将细胞悬液转移到磁分离柱上，放置在磁架上。

靶细胞将被磁珠吸附在柱上，而未标记的细胞将流出。

4. 洗涤：用 PBS 洗涤磁柱多次，除去未结合的细胞和抗体。

5. 洗脱：使用洗脱缓冲液将靶细胞从磁珠上洗脱，收集洗脱液中的细胞。

细胞分析：分离的免疫细胞可以使用流式细胞术进行分析。

小鼠免疫器官的识别分离实验报告
一、实验目的
1、明确各免疫器官分布与形态结构,熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系.
2、拿握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能.
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器宫.它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤.一般来讲脾脏有三大功能首先它是人体的"血库",当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量:
其次,脾脏犹如一台"过滤器",当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用.脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板.因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少.脾脏还有产生淋巴细胞的功能.
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞.
小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞县液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞县液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞.
三、实验器材KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净.
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS冲洗,制得脾细胞晨液.
3、将制得的脾细胞晨液转移到10ml的离心管中,1000r/min5min离心洗涤,倒掉上清,加入5 mIPBS再离心洗涤一次.。

小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。

分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法骨髓是一种重要的免疫器官，它主要负责成熟和存储多种不同类型的免疫细胞，如粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等。

因此，分离小鼠骨髓中的免疫细胞对于研究免疫系统的功能和生理学意义具有重要意义。

本文将介绍一种常用的分离小鼠骨髓中免疫细胞的方法。

一、实验材料准备1.小鼠骨髓2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）3.甘露糖4. L-精氨酸血红蛋白（LymphoprepTM）离心管二、小鼠骨髓分离1.从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓。

用PBS冲洗骨髓，使之保持湿润。

2.将骨髓加入含有10%甘露糖的PBS中，制成单细胞悬浮液。

3.将单细胞悬浮液缓慢地加入L-精氨酸血红蛋白离心管中。

4.用Lymphoprep离心管离心，离心条件为800 g，20分钟，室温。

三、免疫细胞的分离1.离心完成后，可以看到在离心管中分层形成了三明显的界面。

上层是血浆，中层是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，下层是红细胞。

2.使用移液管沿着离心管壁缓慢吸取中层的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，并将其转移至新的离心管中。

3.加入PBS冲洗淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，使之保持湿润。

4.用PBS洗涤细胞三次，以去除离心试剂和其他污染物。

5.将细胞转移到培养皿中，并采用适当的培养基进行培养和分离。

四、实验注意事项1.在进行分离实验时，应尽量避免产生气泡，以免对细胞的分离和纯度产生影响。

2.离心时，离心管应该尽量垂直摆放，避免出现倾斜，以免影响细胞的分层。

3.分层完成后，移液管在取出上层血浆时，应尽量避开中层的细胞，以免受到污染。

五、实验结果通过上述方法分离得到的小鼠骨髓中的免疫细胞，其纯度高，可以用于继续进行免疫学、细胞生物学方面的实验研究。

六、结论分离小鼠骨髓中的免疫细胞是一个重要的实验技术，可以为后续的免疫学研究提供重要的细胞材料。

在实际操作中，需要严格控制每一个步骤，以确保分离得到的免疫细胞的纯度和活力。

同时，也需要注意安全操作，避免对实验材料和人员产生伤害。

从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。

一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。

二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。

本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。

三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。

2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。

3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。

4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

小鼠全身淋巴结的分布及摘出方法淋巴结是末梢淋巴器官，是位于淋巴管通路上的淋巴过滤器官，可清除淋巴液中的异物、病菌和进行免疫反应。

它和脾脏一样，是与免疫反应，特别是与抗体的产生过程关系最密切的器官，作为与免疫反应有关的器官，此外还包括骨髓和胸腺，但从抗体产生的量来看，都远不及脾脏和淋巴结。

淋巴结中聚集着数种形态上可以区别的淋巴细胞。

处于免疫状态的动物的淋巴结内，大量的浆细胞聚集在一起，旺盛地产生抗体。

淋巴结就是这样在免疫过程中起着重要的作用。

实际上，在免疫学中，抗体产生过程的详细研究都是用取自脾脏及容易得到的淋巴结和淋巴结内的淋巴细胞进行的。

例如用取自脾脏和淋巴结的细泡悬浮液在体外检查抗体产生细胞，是免疫学研究中很重要而又容易进行的实验。

淋巴结的摘除，在技术上非常容易，关键在于要正确了解淋巴结的位置。

一、小鼠全身主要淋巴结的名称及分布小鼠淋巴系统特别发达，外来刺激可使淋巴系统增生。

因此易患淋巴系统疾病。

小鼠全身主要淋巴结有：前淋巴结、中淋巴结、深淋巴结、肩淋巴结、腰动脉淋巴结、腰淋巴结、腹股沟浅淋巴结、腹股沟深淋巴结、骼外淋巴结、骼内淋巴结等。

小鼠淋巴管的中缝，皮下的结缔组织中和肌肉之间，或者体腔内的内脏的附近都分布有淋巴结。

这些淋巴结中，位于皮下和肌肉的在体轴的左右两侧对称分布，附着于内脏的则沿体轴分布。

二、器材和动物准备1．器材摘出淋巴结手术需用小鼠解剖台，固定四肢用钉、尖圆手术剪、眼科尖头小剪、弯圆无钩眼科小镊、1ml注射器及5号针头、玻璃探针、生理盐水、棉球，如需要摘出淋巴结后观察动物变化，则还需要增加消毒和无菌操作基本器材，并需要在无菌操作下摘出淋巴结和缝合组织。

2．正常成年近交系或封闭群小鼠动物饲养环境对小鼠淋巴结的数量，大小和形态有一定影响，而且在不同的个体也有点差异，一般来说在不清洁的环境中饲养的动物，淋巴结较发达，所以，与无菌动物相比，普通动物的淋巴结较发达。

有人报告，小鼠淋巴结大小有品系差异，Albert和Johason(1962)研究了几个品系的淋巴结的大小(重量)，发现C3H的淋巴结最大。

小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。

步骤：1.烘烤。

用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。

烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。

2.割尾。

烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。

3.止血。

用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。

要点1.烤：烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。

烤的太过：小鼠死亡。

2.割：割的太浅：血液不流出。

割的太深：鼠尾被割断。

后续应用：取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。

所取血可用于血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。

附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血小鼠脾淋巴细胞分离所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm 中皿及血球计数板一块。

所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。

分离原理示意图图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图分离步骤及要点：1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。

2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。

换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。

脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。

取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。

注意无菌操作。

3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

淋巴细胞提取一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二实验对象：B／C 小鼠三实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。

用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。

（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。

5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。

离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。

倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。

五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。

覆盖层不必太厚，2Μl足矣。

②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。

否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。

其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。

为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。

本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。

二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。

3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。

ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。

B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。

ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。

iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。

ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。

iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。

iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。

D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。

ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。

三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。

2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。

3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。

四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。

然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。

可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。

2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。

淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。

通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。

淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。

淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。

其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。

取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。

脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。

首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。

第二步，制备单细胞悬浮液。

将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。

随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。

第三步，加入淋巴细胞分离液。

将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。

淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。

第四步，离心分离。

将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。

离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。

离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。

第五步，收集淋巴细胞。

将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。

用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。

重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。

通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。

这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。

淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。

因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。

本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。

2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。

2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。

3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。

2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。

2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。

3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。

4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。

2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。

2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。

3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。

3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。

3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。

具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。

4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。

通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。

这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。

小鼠t细胞分离步骤小鼠T细胞分离步骤T细胞是免疫系统中的重要成分，它们能够识别和攻击感染体内的病原体。

因此，对T细胞的研究对于疾病的治疗和预防具有重要意义。

本文将介绍小鼠T细胞的分离步骤。

步骤一：收集小鼠淋巴结需要从小鼠身上收集淋巴结。

淋巴结是免疫系统中的重要组织，其中包含大量的T细胞。

收集淋巴结的方法有多种，可以选择颈部、腋窝或腹股沟等部位进行切割。

收集后，将淋巴结放入含有PBS （磷酸盐缓冲液）的离心管中。

步骤二：制备单细胞悬液将淋巴结放入离心管中后，需要将其制备成单细胞悬液。

具体方法是用剪刀将淋巴结切碎，然后用过滤网过滤掉大块组织。

接着，用PBS洗涤细胞，使其成为单细胞悬液。

步骤三：离心分层将制备好的单细胞悬液放入离心管中，进行离心分层。

离心分层的目的是将不同密度的细胞分离开来。

在小鼠T细胞的分离中，需要将淋巴细胞和单核细胞分离开来。

离心分层的条件可以根据实验需要进行调整。

步骤四：T细胞的筛选将离心分层后的细胞进行筛选，以分离出T细胞。

T细胞的筛选可以使用多种方法，如磁珠分离、流式细胞术等。

其中，流式细胞术是一种常用的方法。

通过标记T细胞表面的特定抗原，然后使用荧光素等物质进行检测，从而分离出T细胞。

步骤五：培养和检测将分离出的T细胞进行培养和检测。

培养条件可以根据实验需要进行调整，一般需要提供适当的营养物质和生长因子。

检测T细胞的方法有多种，如细胞增殖实验、细胞毒性实验等。

总结小鼠T细胞的分离步骤包括收集淋巴结、制备单细胞悬液、离心分层、T细胞的筛选、培养和检测等。

这些步骤需要仔细操作，以确保分离出的T细胞质量和数量符合实验要求。

通过这些步骤，可以为T细胞的研究提供重要的实验基础。

肝脏淋巴细胞分离protocol
1. 腹腔注射100uL/只小鼠麻醉;
2. 用约20mL PBS从下腔静脉处灌洗(肾,肺,肝均变白,肝脏灌注也可);
3. 取10cm细胞培养皿,加入10mL 10% FBS+DMEM,将滤网浸于其中,取出的肝组织置于滤网中;
4. 用1mL注射器的内芯研磨,制备细胞悬液;
5. 从皿中吸取细胞悬液到50mL离心管,补加PBS至30mL;
6. 50g离心3min,上清转移至新管;
7. 1500rpm X 5min离心,2.5mL DMEM重悬细胞。

8. 准备percoll:
6mL 100% percoll + 660uL 10X PBS配成90% percoll
4mL 90% percol + 1.12mL DMEM配成70% percoll
2.5mL细胞重悬液+ 2mL 90% percoll配成40% percoll;
9. 将40% percoll细胞悬液沿管壁缓缓加入70% percoll中;
10. 2000rpm离心20min,brake和accelerate都设为level 1;
11. 吸取中间层细胞,PBS补加到10mL,400g离心10分钟;
12. 弃上清,加1mL红细胞裂解液,裂解2min
13. 补加PBS到10mL,终止裂解,400g离心10分钟
14. 将细胞重悬到合适体积,计数,用于下游分析。

实验三小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取一、实验目的1、了解小鼠淋巴结的分布特点2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术二、实验原理淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。

淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。

小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3所示。

淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。

三、实验仪器和试剂1、仪器设备显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等2、试剂和材料（1）实验小鼠（2）生理盐水（3）75%酒精四、实验步骤1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。

2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。

3、淋巴结淋巴细胞的分离：（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。

（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。

（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。

（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。

4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。

五、注意事项1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。

2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。

3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。

4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。

5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。

六、结果分析试验结果如图所示图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。

淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。

实验三小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取一、实验目的1、了解小鼠淋巴结的分布特点2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术二、实验原理淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。

淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。

小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3 所示。

淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。

三、实验仪器和试剂1、仪器设备显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等2、试剂和材料（1）实验小鼠（2）生理盐水（3）75%酒精四、实验步骤1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。

2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。

3、淋巴结淋巴细胞的分离：（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。

（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。

（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。

（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。

4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。

五、注意事项1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。

2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。

3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。

4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。

5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。

六、结果分析试验结果如图所示图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。

淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。