第三章 酶蛋白的化学修饰

第四节 亲和标记及其判定
亲和标记 (Affinity Labeling）
亲和标记是最有意义的一种化学修饰，这是 因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。 亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合 在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特 定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失 活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和 底物含有共同的结合于酶的基团。
亲和标记反应动力学公式
由于 Vm = k[E0]， V = kobs[E0] ， 由上式可得到 :
式中k为修饰步骤的真实速度常数，kobs 为测定的速度常数。此速度常数为一级速 度常数。 此式双倒数作图为直线。由直线斜率和Y 轴截距可计算k和Ks。
实验判断
动力学方法是最广泛易行的亲和标记实 验判断方法。 实验设计： 选择若干修饰剂浓度，在可测定的条件 下浓度差距越大越好。对每个浓度作失 活过程实验，半对数作图得到速度常数 测定值。以kobs对修饰剂浓度作图，为正 比直线的是简单二级反应，为双曲线 （双倒数作图为直线）的是亲和标记。
亲和标记的判断实例
（From Tian WX., Wang YS. And Hsu R.(1989) Biochim.Biophy. Acta 998, 310）
典型实例：TPCK专一作用胰凝乳蛋白酶
对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯
对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮
胰凝乳蛋白酶合成底物
TPCK
TLCK专一作用胰蛋白酶
对甲苯磺酰-L-赖氨酸甲酯 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮
胰蛋白酶合成底物
TLHale Waihona Puke BaiduK
亲和标记的动力学特征
亲和标记作用过程： 一般化学修饰反应速度和修饰剂浓度成正比。但 亲和标记反应速度：V = k [EI], 不和修饰剂浓度成 正比，而是表现为饱和动力学特征，最大反应速 度为全部酶成为复合物时的速度，即Vm= k [E0]。 按和推导米氏公式类似方法可得到： 式中Vm和V分别为[I]饱和和不饱和 时的失活速度。Ks为可逆结合步骤 的解离常数。