蛋白质组学的研究方法

不 破坏 复 合 物 的结 构; 结 果准确性高
在 高 等真 核 细 胞 中 的 应用 受 到 限 制
适用于研究 自然 条件下 的蛋 白质 相 互作用
同位 素 亲和 标 签 ( ICAT ) 技术
利用稳定同 位 素稀 释 原理 发明, 应 用 MA LD I- TOF 和 LC /M S /M S 进行 蛋白 质差异表达的定量分析技术.
2 蛋白质组学研究方法
蛋白质分离技术、鉴定技 术 ( 如生物质谱技 术 )、蛋白质相互作用分 析技术以及生物数据库 技术是蛋白质组研究的关键技术. 近年来, 这些技 术有了较快的发展, 在此基础上又出现了许多新
收稿日期: 2010- 10 - 11
的方法. 2. 1 蛋白质分离技术 2. 1 . 1 双向电泳
乃至单分子分析成为可能.
白混合物通过消化得到各种肽段, 上样于强阳离
2. 2 蛋白质鉴定技术
子交换柱, 然后不连续梯度洗脱到反向色谱柱Fra Baidu bibliotek,
2. 2. 1 生物质谱技术
再用具备梯度洗 脱能力的洗脱液 洗脱反向色谱
生物 质 谱 技术 是 通 过 测 定 样 品 的 质荷 比 柱, 对洗脱液直接用质谱进行解析 [ 6- 7] . M aor等
[ 5] 钱小红, 等. 蛋白质组学: 理论与方法 [ M ] . 北京: 科 学出版 社, 2004: 1- 343.
[ 6] W ashburn M P, et a.l Large- scale analysis of the yeast pro teom e by m u ltid im ens ion al protein ident ification tech - nology [ J] . N at B iotechno,l 2001, 19( 3) : 242- 247.
第 26卷 第 3期
哈尔滨师范大学自然科学学报 NATURAL SC IEN CES JOU RNAL OF HARB IN NORMA L UN IVER SITY
V o.l 26, N o. 3 2010
蛋白质组学的研究方法
张玮钰, 崔继哲
(哈尔滨师范大学 )
摘要 综述了近年来蛋白质组学研究中较为重 要的蛋白质分离、蛋白质鉴 定、蛋白质相互作用以及生物信息学等技术.
道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技 有的局限性, 如 L eu和 Ile、Lys和 G ln 不能区别;
术. 包括毛细管自由流动电 泳、毛细管区带电泳 有些多肽的固有序列不能用质谱测定; 无法区分
等. 其优点是可实现在线自动分析, 可用于相对分 分子量和带电电荷相同的同分异构体等. 最为重
子质量范围不适于 2- DE 的样品; 其缺点是存在 对复杂样品分离不完全的现象 [ 4] . 毛细管电泳实
对 混合 样 品 进 行直 接 测 试 而不 需 分 离; 能鉴 定 低 丰度蛋白质
无 法 检测 不 含 半 胱氨酸的蛋白 质; ICA T的相 对分 子 量较小, 增加了 数 据 库 搜索 算 法 的 复杂性
适用于混合样品的定量分析
蛋白质芯片
将蛋白质排 列在 固定 支持 物 (如玻 璃 片, 多孔胶片 或 微井 ) 上, 将 标 记后 的 探针靶分子与微点阵进行杂交, 用合适 的检测系统对 靶蛋 白进行 定性或 定量 分析.
毛细管电泳 ( capillary e lectrophoresis, CE ) 又 称高效毛细 管电泳 ( high perform ance capillary e
84
哈尔滨师范大学自然科学学报
2010年
lectrophoresis, H PCE) , 是一类以毛细管为分离通 于实现自动化等优点. 但质谱技术还存在一些固
关键词: 蛋白质组学; 蛋白质分离; 蛋白质鉴定
1 蛋白质组学
1994年 W ilk ins和 W illiam s[ 1] 提出了蛋白质 组学 ( P ro teom ics) 的概念. 蛋白质组学研究在特定 环境、不同条件、不同细胞类型或特定生长发育阶 段某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白 质. 研究内容包括蛋白质的差异表达、蛋白质鉴定 和定量分析、翻译后修饰、亚细胞定位、生理功能 及其相互作用网络等. 蛋白质组学从整体蛋白质 的水平, 更深入、更接近生命本质的层次去发现和 探讨生命活动的规 律及重要生理 病理现象的本 质.
蛋白质组学是后基因组时代十分活跃的研究 领域. 随着人类基因组计划的完成, 蛋白质组学的 研究日益受到重视. 近几年, 国际上有关蛋白质组 学的研究文献也呈指数级上升. 目前, 蛋白质组学 研究已经成为生命科学的热点领域, 蛋白质组研 究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代 的里程碑, 也是后基因组时代生命科学研究的核 心内容.
双向凝胶电泳技术 ( Tw o- d im ensional ge l e lectrophoresis, 2D - PAGE ) 是常用的蛋白质分离 技术, 该技术由 O F arrell于 1975年创立, 主要依 据蛋白质的等电点和分子量, 使疏水性和相对丰 度不同的复杂蛋白混合体系得到分离. 此技术的 优点在于 它能够 研究蛋 白的翻 译后修 饰 ( 磷酸 化, 糖基化 等 ) . 但此技术的重现性不 高, 而且容 易导致蛋白丢失 ( 主要是疏水性、低溶解度、极酸 或极碱的蛋白质 ) ; 对蛋白质分析的能力有限, 只 能同时分析上千个蛋白质, 不足以满足高通量分 析蛋白质的需要 [ 2] . 2. 1. 2 高效液相色谱
[ 2] PandeyA. A n evaluat ion of the use of tw o - d im ens ional gel e lectrophores is in p roteom ics [ J] . B iom ol Eng, 2001, 18 ( 5) : 195 - 205.
3 展望
虽然蛋白质组学的研究方法很多, 但每种方 法都有不足之处. 我们有理由相信, 随着科学技术 的不断发展, 基因组研究的不断拓展, 新技术方法 的不断突破, 蛋白质研究数据的不断积累和生物 信息学技术的不断完善, 蛋白质组学必将取得突 飞猛进的发展.
参考文献
[ 1] W as inger V C, et a.l Progress w ith gene- p roduct m app ing the M oll icu tes: m ycop lasm a en italium [ J] . E lectrophor, 1995, 16: 1090 - 1094.
第 3期
蛋白质组学的研究方法
85
互作用分析技术与质谱技术有机结合而形成的新 型技术. 该方法较简便、快捷. 常用于功能性蛋白 质的筛选. 2. 3 蛋白质相互作用分析技术
细胞中的各种生命活动与蛋白质间的相互作 用紧密相关, 因此深入了解蛋白质相互作用, 研究 出全蛋白质组相互作用网络是揭示生命活动奥秘 的前提. 但是蛋白质的表达具有时间和空间上的 差异性, 且每种蛋白质又有多个相互作用因子, 因 此, 蛋白质相互作用的研究就更复杂, 具有一定的 难度. 目前, 已建立了包括酵母双杂交系统、免疫 共沉淀、串联亲和纯化 ( TAP) 技术、同位素亲和标 签 ( ICAT )技术以及蛋白质芯片等多种研究方法, 这些方法各有所长, 为蛋白质相互作用的研究提 供了有效的分析方法, 为蛋白质组学研究奠定了 坚实的基础. 表 1列举了这几种蛋白质相互作用 分析技术并对这几种方法进行了比较. 2. 4 生物信息学技术
( m /z ) 来进行成分和结构分析的, 是蛋白质鉴定 用此法鉴定出 294种带 GST 标签的泛素结合区
的主要技术 [ 5] . 它具有 灵敏度高、准确性好且易 域捕获的蛋白质 [ 8] . 其缺点是不能量化.
表 1 蛋白质相互作用主要分析技术比较
技术名称 酵母双杂交
作用机理 只有靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后, 其 中的诱饵蛋白 结合 于报道 基因的 启动 子才能启动报 道基 因在酵 母细胞 内的 表达, 通过检测报道基因表达产物判别 作为 诱饵 和 靶蛋白 的两个 蛋白间 是否存在相互作用 [ 10] .
优点 灵敏度高
缺点
适用范围
易 产 生假 阳 性 结 果; 只有定位于 核 内 的 相互 作 用 蛋 白 才 能确 保 报 告 基因的激活 [ 11]
常用于发现 和研 究新蛋 白质 的相 互 作用和功能, 以及无损地研 究抗原和 抗体的相互作用
免疫共沉淀
利用非变性剂裂解完整细胞. 细胞内许 多蛋白质间的相互作用可以保持下来. 如果蛋白 质 X 用其 抗体 免疫 沉淀. 则 在细胞内与 X 稳定结合的蛋白质 Y 也 能沉淀下 来. 蛋白 质 Y 的 沉淀 是基 于 与 X的物理 性 相互 作用, 被称 为免 疫 共沉淀 [ 12] .
高效液相色谱 ( h igh perform ance liqu idchrom atography, HPLC ) 最 初 被用 于 分离 蛋白 质 或多 肽. 近年来, 高效液相色谱已成功应用于蛋白质组 学中, 它是基于样品分子在固定相 (柱填料 )和流 动相 ( 淋洗液 ) 之间的特殊相互作用而实现样品 分离的. 无须变性处理样品, 可实现上样、收集、在 线分析的自动化. 与双向电泳相比, 它具有快速、 分辨率高的优点 [ 3] . 2. 1. 3 毛细管电泳
[ 3] R om ijn E P, et a.l R ecen t l iqu id ch rom ato- graph ic- ( tan dem ) m ass spectrom etric app lications in p roteom ics [ J] . J C hrom atogr A, 2003, 1000( 1- 2 ): 589- 608.
上 样量 小; 分 辨 率高; 设 备 简单
该 技 术受 蛋 白 质 固 定 化技 术 以 及 载 体 材料 选 择 的 限制
主要是研究 差异 显示的 蛋白 质以 及 蛋白质间的相互作用; 高通 量快速筛 选
2. 2. 3 生物传感芯片质谱 生物传感芯片质谱是定性和定量检测蛋白质
间相互作用, 并对其进 行鉴定的方法 [ 9] . 它是以 表面等离子激原共振 SPR 为基础的生物分子相
生物信息学是在生命科学、计算机科学和数 学的基础上逐步发 展而形成的一 门新兴交叉学 科, 是以理解各种数据的生物学意义为目的, 运用 数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加 工、存储、传播、分析与解析的科学 [ 15] . 在蛋白质 组学研究中, 生物信息学方法可以用于诠释实验 结果, 以发 现 蛋 白质 的 结 构、功 能 及 其 相 互作 用 [ 16] . 常用的数据库有: SW ISS- PROT、BLO CK S、 SMART、PROSITE、W ORLD - 2DPAGE、EMBL、 GenBank、DDB J、P roC lass、PR INTS、MASCOT、PRO TOMAP、DOMO、PDB 等.
能 鉴定 经 翻 译 后修 饰 的 天然蛋白
过程相对复杂
常用来确定 生理 条件下 目的 蛋白 在 细胞或组织 内是 否存在 与其 相互 作 用的蛋白质; 具有高表达量 的目标蛋 白
串联 亲 和纯 化 ( TA P ) 技 术
利用一种经过特殊设计的蛋白标签, 经 过两步连续的 亲和 纯化获 得更接 近自 然状 态 的 特 定 蛋 白 复 合 物 的 技 术 [ 13- 14].
[ 4] G arcia- C am pana AM, et a.l D erivatizat ion of b iom olecu les for chem ilum inescent detection in cap illary electrophoresis [ J] . J C hrom atogr B A nalyt Technol B iom ed L ife Sc,i 2003, 793 ( 1 ) : 49- 74.
要的是仪器较昂贵. 2. 2. 2 多维蛋白质鉴定技术
际上包含电泳、色谱及其交叉内容, 它使分析化学
多维蛋白 质鉴定 技术 ( m ultid im ensiona l pro
得以从微升水平进入纳升水平, 并使单细胞分析, te in identif ication technology, M udP IT ) 是指将总蛋