鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定
李莹姝蒋华云*
（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）
摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。溶菌酶得率为0.0474mg/100ml
（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGE
Extraction, purification and purity of Egg lysozyme
Yings Li Huay Jiang*
(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)
Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.
Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE
溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂, 在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。[1] [2]
溶菌酶来源广泛, 人、动物、植物和微生物中均有发现, 其中鸡蛋清中含量较高, 因此, 工业生产溶菌酶常以鸡。蛋清为原料鸡蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶[3]，其化学性质稳定，纯品为白色或微黄色结晶体，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一种分子量在14～15kD，等
电点pH 值在11.0 左右，最适效应温度在50℃，最适pH 值为6.0～7.0 的碱性球蛋白。它的生
物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。溶菌酶的抗菌及抗病毒活力与pH 值有关，在酸性介质中，活力显著增强。当前, 溶菌酶的制备有多种方法，最常用的是离子交换树脂吸附法[4]。
溶菌酶的用途很多，由于它本身是一种天然蛋白质，无毒性，可以作为防腐剂、保鲜剂。在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学。溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取，在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于破坏细胞壁，制备无菌提取液。溶菌酶所具有的广泛用途吸引了国内外众多学者对其进行研究，已发表不少关于溶菌酶的试验报道。
1材料和方法
1.1材料与仪器
新鲜鸡蛋3颗,购自市场；724型酸性阳离子交换树脂；灭菌纱布；1 mol/L NaOH ，1 mol/L HCl ；蒸馏水（实验室桶装水）；磷酸缓冲液（pH 6.5，0.15M ）；10％（NH 4）2SO 4溶液；固体（NH 4）2SO 4 ；BaCl 2 ； 12﹪分离胶；4﹪浓缩胶；Tris-甘氨酸电极缓冲液； loading Buffer ；标准蛋白Marker ；
染色液（考马斯亮蓝G-250）；脱色液（冰乙酸，甲醇）；葡聚糖凝胶（SephadexG-75）；蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL ）； G-75洗脱液（KCl ，HAc ）
电子分析天平；真空泵；超声振荡器；布氏漏斗，循环水式多用真空抽滤泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通离心机，高速冷冻离心机；透析袋，磁子，磁力搅拌器，玻璃层析柱（20mm×15cm），恒流泵，细滴管，Bio-Rad 层析系统设置，部分收集器；水浴锅；Bio-Rad 垂直电泳系统（制胶系统、电泳槽）；脱色摇床；可见分光光度计(UV-1100型)；紫外分光光度计；微量移液器；4℃冰箱；容量瓶；精密pH 试纸；等。
部分试剂详细配方及配法见附录I
1.2实验方法
1.2.1阳离子交换法提取溶菌酶
树脂预处理：干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质； 1 mol/L 的HCl 浸泡2 h ，去离子水洗3次至至近中性；抽滤收集树脂,1 mol/L 的NaOH 溶液浸泡2 h ，去离子水洗3次至近中性；抽滤收集树脂,加0.15 mol/L 、pH 值为6．5的磷酸缓冲液平衡过夜待用。 蛋清制备：将3个新鲜鸡蛋洗净干燥，小端敲一个小洞，大端打一个小孔进气，分离得鸡蛋清，用1 mol/L HCl 调节PH 到7。过滤前称量烧杯重48.7g ，缓慢搅拌用灭菌的两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，蛋清与烧杯总重207.5g ，蛋清净重158.8g 。用1 mol/L 的HCl 溶液调pH 值至7.0，量蛋清体积为100 ml 。在调节PH 时蛋清中出现少量白色沉淀，可能为部分蛋白由于局部过酸而变性。
吸附：蛋清在不断搅拌下加入抽滤好的724树脂25g （相当蛋清四分之一体积的树脂），冰水浴中磁力搅拌器缓慢搅拌（使树脂全部悬浮在鸡蛋清中，搅拌不能起泡）吸附2.5 h ，4℃静置1.5h 。然后3000r/min 离心15min 分层，收集树脂，回收蛋清（留样A ）。
去除杂蛋白：收集树脂用去离子水振荡水洗直至洗液澄清（至无白沫为止），吸管轻吸去洗液，以去除杂蛋白。（每洗1次，离心1次，总共3次）冰浴中用等体积的0.15mol/L 、pH =6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min ，抽滤，重复洗三次，注意防止树脂流失。最后一次抽滤滤除树脂水分至干燥。
洗脱溶菌酶：树脂中加入35ml （等体积）的10％（NH 4）2SO 4溶液搅拌洗脱30 min ，抽滤,使
溶菌酶从树脂上洗脱下来，重复两次，合并收集洗脱液（留样），洗脱液过滤后，准确量取体积100ml 。（留样B ）
盐析:每83mL 洗脱液加32g 磨细的固体（NH4）2SO4，本实验中总量为38.55g 。缓慢加入（NH 4）2SO 4搅拌待完全溶解后保鲜膜封口，置于4℃冰箱盐析过夜。
透析:待白色沉淀析出，3000r/min 离心15 min ，收集沉淀，用去离子水将沉淀洗下并全部溶解（4.5ml 去离子水），装于透析袋中，于去离子水中透析（冰浴），期间2次更换去离子水，直至用BaCl 2检测透析完全。透析装置中加入磁子，于磁力搅拌器中搅拌加快透析速度。
去杂质蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl 调整pH4.6，产生少量白色沉淀（留样D ），可能为杂蛋白。3000r/min 离心10min ，收集上清液（留样C 20ul ）。
浓缩：用PEG-20000浓缩上清液至1.5ml （留样E ，20ul ，加loading buffer,出现黄色（可能为浓缩时透析袋中渗入了PEG-20000）。[5] [6]
凝胶溶胀及预处理:取足量SephaexG-75于烧杯中加入20倍体积洗脱液，置室温溶胀2天。反复倾泻去掉细颗粒，并泵脱气；洗脱液用超声脱气完全。
