碱性磷酸酶的分离提取课件

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碱性磷酸酶的分离提取
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• 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反 应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色
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• 酶活性单位（U/ml)=
A样 A标
*0.1*稀释倍数
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• 在悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30% （0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清液于另一离心管。
• 上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，沉淀用 4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。
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碱性磷酸酶的纯化
• 其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达
到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min，取 上清液丢弃沉淀。
• 上清液中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 • 沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作
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实验原理
❖碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二
• 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶
液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。
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碱性磷酸酶的提取
• 称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。 将其转入离心管，并加2ml 0.01 mol/L的醋酸镁 及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心 管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml 作为A液于EP管，待测比活性用。
为D液用于比活性测定。
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碱性磷酸酶活性的鉴定
磷酸苯二钠 AKP
磷酸盐 + 酚
酚 + 4-氨基安替比林 铁氰化钾 红色醌类衍生物
AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为 激活剂。
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• 碱性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33% 丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成 沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离， 从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以 获得较高纯度的AKP。
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实验目的
1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、 分• 光等方法，从组织中分离纯化 及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技 术及鉴定的方法
碱性磷酸酶的提取鉴定
朱** 金** 王** 何*
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碱性磷酸酶
• 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸 酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，
产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可
以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷 酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
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如何获取碱性磷酸酶
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蛋白质含量测定基本原理 ——BCA法
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碱性磷酸酶的提取
• 在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅 拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心 管。
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碱性磷酸酶的纯化
• 滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后 3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管， 待测比活性用。