细菌的芽孢染色和形态观察
胡雪芳 201300261033
【实验目的】
1.掌握芽孢染色方法，观察芽孢形态特征。
2.了解芽孢的性质与染色的关系。
3.巩固显微镜的使用和无菌操作技术。
【实验原理】
1.芽孢
1.1 芽孢性质
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常为圆形和椭圆形。是否产生芽孢以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。
与正常菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，一般染色法只能使菌体染色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状），但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。
芽孢染色法根据芽孢特点设计，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
1.2 芽孢的结构
芽孢的结构如下：
图1. 细菌芽孢构造模式图
芽孢囊：是产生芽孢菌的营养细胞外壳
孢外壁：主要含脂蛋白，通透性差（有的芽孢无此层）
产芽孢细菌芽孢衣：主要含疏水性角蛋白，抗酶解、抗药物，多价
阳离子难通过
芽孢皮层：主要含芽孢肽聚糖及DPA-Ca，体积大，渗透压高
芽孢壁：含肽聚糖，可发展为新细胞的壁
核心芽孢质膜：含磷脂、蛋白质，可发展成新细胞的壁
芽孢质：含DPA-Ca、核糖体、RNA和酶类
核区：含DNA
2.芽孢染色的染料——孔雀绿
孔雀绿是一种弱碱性染料，芽孢染色主要依赖于对芽孢结构特征的染色和利用——壁厚，通透性差等。通过依靠加热的方法促进该染料穿过厚壁进入了芽孢，然后利用壁厚，在水洗脱时又难以出来的特征，使芽孢保有初染染料。而该染料与细胞的结合能力较弱，被水洗后，结合了着色力强的复染染料。
【实验材料】
1.菌株
产芽孢细菌：梭状芽胞杆菌、环状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌
2.培养条件（培养基、温度37℃、时间）
枯草芽孢杆菌1.4255：牛肉膏蛋白胨固体培养基，48h已释放，24h
芽孢少，合适的时间36-48h。
球形芽孢杆菌：牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养72h，有芽孢，胞内未释放，产芽孢菌不足1/3。合适的时间3-3.5天。梭状芽胞杆菌：牛肉膏蛋白胨固体培养基，24h有芽孢释放，培养时间可控制在20-24h，时间长了基本都释放了。
环状芽孢杆菌：牛肉膏蛋白胨固体培养基，48h时培养物大量芽孢已释放，观察胞内状态的合适时间应在24-48h之间。
3.试剂
芽孢染色液——5%孔雀绿和5%番红水溶液
蒸馏水/生理盐水，双层瓶、香柏油、二甲苯等。
4.其他
普通光学显微镜、吸水纸、擦镜纸、滤纸、载玻片、酒精灯、接种环、木夹、电炉（加热）等。
【实验步骤】
1.制片
按常规方法涂片、干燥及固定。
2.加热染色
剪一与涂片大小合适的滤纸片（小于载玻片边缘），覆盖于涂片处，滴加数滴5%孔雀绿于滤纸片上。
方式一：用木夹夹住载玻片一端，在酒精灯上（可控性差）或者电炉上（可控性好）微火加热至微冒蒸汽，脱离热源，添加染液，再加热至微冒蒸汽，持续5min，冷却。
方式二：将载玻片置于蒸汽浴上加热5-10min，适时添加染液，冷却。
3.脱色
待载玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
4.复染
用5%的番红水溶液复染2min。
5.水洗
用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
6.镜检
将载玻片晾干后油镜镜检。
【实验结果】
1.实验观察结果
观察分别接种有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和梭装=状芽孢杆菌（Clostridium sporogenes）的菌落形态，枯草杆菌菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，梭装芽孢杆菌菌落扁平，不规则。
镜检观察，芽孢呈绿色，芽孢囊为红色。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌体形态为短杆状，末端钝圆，单生或形成短链，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，含芽孢菌体不膨大。梭装芽孢杆菌（Clostridium sporogenes）芽孢呈圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状。
2.实验绘图记录结果（见附图）
【分析与讨论】
1.在观察梭装芽孢杆菌（Clostridium sporogenes）芽孢时，发现有
些部位孔雀绿水溶液染色过深，导致水洗时无法完全洗去，影响观察。以后实验中应注意孔雀绿水溶液加入的量，及加热时间，防止染色过深。
2.选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经
破裂；
3.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体
或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色；
4.脱色必须等待玻片冷却厚进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片
破裂。
