溶菌酶的研究进展

溶菌酶的底物特异性很强 ,不同来源溶菌酶作用的 底物不同 。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶 、动物溶 菌酶 、植物溶菌酶 、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶 。 按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞 壁溶菌酶 。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种 ,一种是作 用于 β21, 4 糖苷键的细胞壁溶解酶 ,另一种是作用于肽 链“尾 ”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶 。真菌细胞壁溶 菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶 。 溶菌酶大体分为 5 种 : ( 1)内 N 2乙酰己糖胺酶 ,此酶同 于鸡蛋清溶菌酶 ,破坏细菌细胞壁肽聚糖中的 β2114 糖 苷键 。 ( 2)酰胺酶 ,切断细菌细胞壁肽聚糖中 N 2乙酰氨 基葡萄糖胺与肽“尾 ”之间的 N 2乙酰胞壁酸 2L 2丙氨酸 键 。 ( 3)内肽 酶 , 使 肽“尾 ”及 肽“桥 ”内 的 肽键 断 裂 。 (4)β2113、β2116葡聚糖酶和甘露聚糖酶 ,此酶分解酵母 细胞的细胞壁 。 ( 5)壳多糖酶 ,这是分解霉菌细胞壁的 一种溶菌酶 [5 ] 。 3 影响溶菌酶活力的因素与酶活力的测定方法 311 影响酶活的因素 : 包括温度 、pH 值 、化学物质 、络 合作用等 。 312 溶菌酶酶活力的测定方法通常有 3种 。
由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质 ,无毒性 ,是一 种安全性高的饲料酶 ,它能专一性的作用于目的微生物 的细胞壁 ,而不能作用于其它物质 。该酶对革兰氏阳性 菌 、枯草杆菌 、耐辐射微球菌有很强分解作用 ;对大肠杆 菌 、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一
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戴清源等 [9 ]报道 ,正常情况下 ,人体尿液中一般只 存在少量溶菌酶 ,因此测量尿中溶菌酶含量 ,有助于检 测肾小管功能障碍性疾病 。同时 ,烧伤病人分泌的溶菌 酶比常人多出几倍 ,也可在尿液中检出 ,有助于对手术 移植排斥 、烧伤严重程度的判断 。此外 ,血清中溶菌酶 含量高低对白血病的诊断起辅助作用 。 414 溶菌酶在畜禽饲料中的应用 41411 用作饲料防腐剂和杀菌剂
随着生物科学的发展 ,溶菌酶已成为基因工程及酶 工程中必不可少的工具酶 ,用以制造和提取菌体内的活 性物质如核酸 、酶及活性多肽等 ,利用其专一性水解细 胞壁的特点 ,有助于人们对细胞壁细微结构的认识 ,为 我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础 ,同时作 为是一种重要的破壁酶 ,在原生质体的制备方面提供了 新的方法 ,因此溶菌酶被广泛应用于生物技术 、生物工 程中 。 413 在医疗中的应用 41311 溶菌酶在抗菌消炎 、增强免疫力方面的应用
主要问题 ,并对其应用前景进行了展望 。
关键词 :溶菌酶 ;抗菌机理
中图分类号 : Q556
文献标识码 : B
文章编号 : 1008 - 9632 (2009) 02 - 0064 - 03
对溶菌酶的研究始于 20 世纪初 ,人们发现人的唾 液 、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶 ,因其具有溶菌 作用 ,故命名为溶菌酶 [1 ] 。1937 年 Abraham 和 Robinson 从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体 ,揭开了研究溶菌酶的历 史篇章 。它广泛存在于鸟类 、家禽的蛋清中和哺乳动物 的泪液 、唾液 、血浆 、乳汁 、胎盘以及体液 、组织细胞内 , 其中在蛋清中含量最丰富 (约 013% ) 。在一些植物体 如卷心菜 、萝卜 、无花果和微生物体内也存在溶菌酶 ,只 是含量差异较大 。 1 溶菌酶的理化性质及空间结构 111 理化性质
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JOURNAL OF B IOLOGY
doi∶1013969 / j1 issn11008 - 9632120091021064
溶菌酶的研究进展
Vo l126 No12 Ap r, 2009
陈 艳 ,江明锋 ,叶煜辉 ,刘勇涛 ,李生伟
(西南民族大学生命科学与技术学院 ,成都 610041)
( 1)以细胞壁作为底物 ,用作用前后浊度的变化表 示酶活力的大小 。
( 2)以溶壁小球菌培养液作为底物 ,用作用前后浊 度的变化表示酶活力的大wk.baidu.com 。由于这两种方法都是用 固液两相反应 ,难以准确测定反应速度 ,故有人将水溶 性多糖 已 二 醇 甲 壳 质 制 备 均 匀 态 底 物 , 用 来 测 定 酶 活力 。
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定的杀灭作用 ; 与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用 ,具 有良好的防腐作用 。在饲料中添加溶菌酶可防止霉变 , 延长饲料的贮存期 ,减少不必要损耗 [10 ] 。 41412 具有防治仔猪腹泻的作用
沈彦萍等 [11 ]报道 ,溶菌酶对防治仔猪腹泻有显著作 用 ,可达到抗生素的使用效果 ,治愈率达 80%以上 。溶 菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系 ,体内溶菌酶主要来 自嗜中性白细胞 、单核细胞及吞噬细胞溶酶体 ,可进入 机体补体系统并增强抗体活性 ,从而杀灭有害微生物 , 因此溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状 病毒都具有较强的抑制作用 。 5 有关溶菌酶的最新研究进展 511 溶菌酶可以固定于一些包装纸上 ,如湿墙纸和玻 璃纸上 ,应用于医院手术室及食品包装 。如用提取的蛋 清溶菌酶配制 ( 2% ～3% )的酶液 ,喷洒于包装纸上或将 包装纸浸入酶液 ( 2～3h) ,取出后在温度 50 ～60℃条件 下烘干 (酶活力基本不损失 ) ,用溶菌酶处理过的包装纸 包装煮熟的大豆和新蒸的馒头 ,结果在贮存近 1 周的时 间内不变味 ;而用普通纸包装的这些食品贮存 1d 就会 变味 (常温下 )发黏 。 [12 ] 512 采用固定化技术将溶菌酶固定在 HEPA (空气过滤 器 )上 ,作为空调的空气净化系统 ,使其具有高效除尘和 杀菌两大功能 。当空气通过滤网时 ,先滤集捕捉尘粒和 细菌 ,然后将捕捉到的细菌杀灭 。 513 用溶 菌 酶 非 专 一 性 地 降 解 海 洋 生 物 高 分 子 壳 聚 糖 ,使其成为能被人体吸收的 、低分子量的 、有独特的生 理活性和功能性质的低聚壳聚糖 。 514 海洋溶菌酶在化妆品中具有抑菌的作用 。
摘 要 :溶菌酶普遍存在于动物 、植物和微生物中 。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白 ,长期以来一直被作为一种“模
型 ”体系 ,用于研究蛋白质的空间构象 、酶动力学及其与分子进化 、分子免疫间的关系 。介绍了溶菌酶的来源 、结
构 、性质 、作用机制 。并对近年来其在食品工业 、医学和酶工程中的应用进行了综述 ;分析了溶菌酶应用中存在的
收稿日期 : 2008 - 06 - 20 作者简介 :陈 艳 (1983 - ) ,女 ,满族 ,黑龙江 ,硕士研究生 ,专业方向 :分子生物学 , E - mail: cyaita831227@1631com; 通讯作者 :江明锋 (1971 - ) ,男 ,羌族 ,副教授 ,博士 , E - mail: m ingfengjiang@ vip1 sina1com。
溶菌酶对 G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用 ,对大 肠杆菌 、普通变球菌等 G- 也具有一定程度溶解 。此外 , 溶菌酶与抗菌素合用效果更佳 ,因而 ,溶菌酶广泛应用 于医药行业 ,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症 ,尤其 对急性炎症如急性咽炎 、急性喉炎 、急性中耳炎等效果 明显 [ 8 ] 。 41312 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用
在过去很长一段时间中 ,溶菌酶一直被当作一种研 究蛋白质空间构象 、酶动力学及分子进化的理想模型 。
其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研 究进展都是利用溶菌酶获得的 [3 ] 。
目前 ,鸡蛋清溶菌酶 HEWL 的酶学性质 、分子结构 、 催化机理乃至酶蛋白基因结构已研究清楚 ,并成为研究 蛋白质结构与功能的一个重要模式蛋白 。已知 HEWL 是由 129个氨基酸残基组成的一条多肽链 ,含有 4 对二 硫键 ,三维结构为一较紧密的椭球形 ; Glu35、A sp52 及 Trp62 残 基 是 酶 活 性 必 需 基 团 ; 同 时 A sp101、A rg114、 Trp108等残基对“底物 2酶复合物 ”的形成也起着重要作 用 ,该酶活性受组氨酸和 N 2乙酰葡糖胺的抑制 。对植物 溶菌酶活性中心的研究较少 ,木瓜溶菌酶中 Trp 残基不 参与底物的结合 , 活性中心除包括 —COOH (A sp / Glu) 外 ,还必需一个 Cys。而且 ,该酶受组胺抑制基本上不受 N 2乙酰葡糖胺抑制 ,这些与 HEWL 有所不同 。赖晓芳 [4 ] 等采用化学修饰等方法 ,对萝卜溶菌酶活性中心进行了 初步研究 ,他们采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析从萝 卜叶中获得了 PAGE均一的溶菌酶 ,并通过微量蒸发扩 散法获得其结晶 。用 pH 动力学研究方法和化学修饰法 对酶的活性中心进行了初步研究 。实验结果表明 : — COOH ( Glu /A sp )基团 、Trp 及 H is残基可能为酶活性所 必需 。对 Tyr、Cys、Ser/ Thr残基修饰后 , 酶活性基本上 不受影响 。同时 ,酶活性受到组胺和 N 2乙酰葡糖胺抑 制 。并且对萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶 的活性中心的相互差异进行了讨论 。现有情况表明萝 卜溶菌酶活性中心与 HEWL 可能不同 , HEWL 的活性中 心只包括 —COOH (A sp / Glu)和 Trp 残基 ;亦与木瓜溶菌
用公式计算出酶活力 。不同酶活的标准酶液对应不同 的 ΔE,而据此 ΔE 又可算出所用标准酶的酶活 ,从而可 验证检测的准确性 [6 ] 。 4 溶菌酶的应用 411 在食品工业中的应用
溶菌酶是一种无毒 、无副作用的蛋白质 ,又具有溶 菌作用 ,因此可用作食品防腐剂 。目前已广泛应用于水 产品 、肉食品 、蛋糕 、清酒 、料酒及饮料中的防腐 ,溶菌酶 属于冷杀菌 ,在杀菌防腐过程中不需加热 ,因而避免了 高温杀菌对食品风味的破坏作用 ,尤其对热敏感的物质 更具有重要意义 [7 ] 。还可以添加到乳粉中 ,使牛乳人乳 化 ,以抑制肠道中腐败微生物的生存 ,同时直接或间接 地促进肠道中双歧杆菌的增殖 。此外 ,还能利用溶菌酶 生产酵母浸膏和核酸类调味品 。 412 在生物工程研究中的应用
( 3)分光光度计测定法 ,在 450nm 处 ,把一定量的菌 体冻干粉或冰浴解冻的溶壁微球菌液溶解于一定量的 磷酸盐缓冲液中 ,使吸光度值在 113 左右 ,此底物溶液 以及标准酶液在温度 25 ℃水浴中保温 。用 1cm 比色皿 装 215mL 底物于水浴中 ,加入 015mL 酶液开始计时 ,记 下反应 1m in时的读数 E1 以及反应 2m in时的读数 E2,
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酶的不同 ,其活性中心除含 —COOH ( Glu /A sp )基团外 , 还含有 - SH 基团 。用 IAA 和 DTNB 对萝卜溶菌酶进行 化学修饰 ,酶活性基本不变 ,用 E IIman试剂法也测不出 酶分子含有游离 —SH 基团 ,只测得酶分子中含有 2111 mol SH 蛋白质的二硫键存在 ,所以萝卜溶菌酶活性中心 可能不含游离巯基 。另外 , HEWL 受组胺和 N 2乙酰葡糖 胺显著抑制 ;而萝卜溶菌酶也受组胺显著抑制 ,但基本 上不受 N 2乙酰葡糖胺抑制 ;木瓜溶菌酶不仅受组胺显著 抑制 ,而且受 N 2乙酰葡糖胺抑制也较强 。这些差异可能 反应了萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶在功 能上的分化 。 2 溶菌酶的分类
溶菌酶 (Lysozyme)是水解酶的一种 ,又称为胞壁质 酶 (muram idase)或 N 2乙酰 胞 壁质 肽 聚 糖水 解 酶 (N acetylmuram ideglycanohydrlase) 。溶 菌 酶 是 一 种 碱 性 蛋 白质 ,在酸性环境下 ,溶菌酶对热的稳定性很强 , pH 值 310时 96℃加热处理 15m in 仍能保持 87%的酶活性 。 在自然条件下 ,大多数溶菌酶化学性质稳定 ,即使当 pH 值在 112 ～1113 范围内剧烈变化 , 其酶结构仍维持不 变 ,活性也不受影响 。但碱很容易使酶活性遭到破坏 , 当处于碱性 pH 值范围时 ,溶菌酶的热稳定性就很差 [2 ] 。 溶菌酶在干燥条件下 ,室温可长期保存 ,其纯品为白色 或微黄色结晶体或无定型粉末 ,无嗅 ,味甜 ,易溶于水 , 不溶于丙酮 、乙醚 。 112 空间结构