使用制备型高效液相色谱的经验之谈之欧阳光明创编

案例一:某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。

欧阳光明（2021.03.07）

解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型.

高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。

方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC

Method→4.优化Preparative HPLC 条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。

更细致地来讲，开始Preparative HPLC 之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV 光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS 检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC 之前是否须经flash column

粗分）；

样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；

建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC 相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；

优化Preparative HPLC 条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC 的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS 测分子量）；

检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！

曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中

溶解度都相当地小，analytical HPLC 虽然分离得很漂亮，但还是没

法做。最后是通过

结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。虽困难，到从合成的角度来讲，也容

易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。同时，也可以回到出发点——了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等

情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。

回收纯化的物质——万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。

可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。冷冻干燥也可以派上用场。具体情况具体分析吧。需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。

案例二：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化

上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及

方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！

对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC 上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC 的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC 上。制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯水中溶解度都不怎么好，甲醇-水混合溶剂，还是不咋的——成了乳浊液了，跟牛奶似的，考虑到流动相里添加了酸，而该化合物又是碱，于是乎，滴加甲酸助溶，边滴加边振摇，样品终究给溶清了，0.45um滤过，备用，待分离。