一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立

一种植物原生质体分离与瞬时转化的方法《一种植物原生质体分离与瞬时转化的方法》，这是一种重要的生物技术，可以用于植物基因组建设、遗传变异诊断、分子突变分析、特质转移和转基因研究。

原生质体可以帮助科学家们把植物的基因和抗性特征转移到其他物种中，为植物的育种和分子育种提供了有效的技术支持。

不同的植物，其原生质体分离和瞬时转化的方法可能有所不同。

一般而言，分离原生质体的技术可分为两类，即离心法和电沉淀法。

离心法是通过从植物细胞中抽取原生质体，通过离心来分离它们，最后以70%乙醇及苯酚混合液来固定它们，从而获得最终的原生质体剂。

电沉淀法则是通过应用电流对原生质体进行分离，最后以20%乙醇及苯酚混合液来固定它们，获得最后的原生质体剂。

瞬时转化技术是指将原生质体植入受精花粉基因组中，以获得抗性特征和遗传变异等。

这也是一种生物技术，它可以大大提高植物育种的效率，帮助人们实现对植物基因组的精确设计。

一般而言，瞬时转化技术也可以分为两类，即原生质体转化（PEG-mediated transformation）和电转化（electroporation transformation）。

原生质体转化是一种使用PEG（聚乙二醇）来驱动原生质体植入植物细胞中的技术，而电转化则是借助脉冲电场的影响，来帮助原生质体进入植物细胞中的技术。

《一种植物原生质体分离与瞬时转化的方法》可以帮助植物育种，更快的获得抗逆性和营养特性的植物，以应对气候变化、抵御病原体侵害等环境挑战。

它也可以帮助科学家们更好地理解植物的基本生物学原理，让人们能够更有效地控制和调整植物的遗传变异和表型表现。

此外，植物原生质体分离与瞬时转化的方法还可以用于植物抗病虫和抗毒物实验。

通过原生质体转化，可以利用碱基改造等技术将抗性基因植入植物细胞，从而使植物具有抗病虫的能力，从而大大减少农药的使用，减轻环境污染。

【结论】植物原生质体分离与瞬时转化技术在植物育种中拥有重要作用。

水稻原生质体分离及转化水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2?2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。

2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。

十四、水稻原生质体提取及转化1.将水稻种子去壳后，用70%酒精清洗30 sec，再用30% 次氯酸钠溶液浸泡30 min。

2.将消毒过的水稻种子植于1/2 MS培养基中，避光培养12-14天后，得到的黄化苗可进行原生质体提取。

3.现配20 mL enzyme solution并置于5 公分塑料培养皿中。

4.取黄化苗水稻茎部用锋利刀片细切至0.1-0.5 mm置于enzyme solution中。

5.将含有水稻材料的enzyme solution 抽气15-20 cm-Hg，15-30 min。

6.28℃，40 rpm持续震荡3 hr。

7.28℃，80 rpm继续震荡30 min。

8.用300目尼龙网布过滤含有原生质体的enzyme solution，将过滤的enzymesolution 250g离心3 min。

9.去除上清液，小心用W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。

10.再次用250g离心1 min。

11.去除上清液，加入W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。

12.原生质体置于冰上30 min后可进行PEG转化。

13.30 min 稍微离心去除上清液，加入MMg solution 使原生质体总数为2-5×105。

14.取5-10 μg Plasmid DNA 体积为20μL，加入200μL 原生质体，置于冰上10 min。

15.加入等体积PEG4000溶液，小心混匀并置于室温下15 min。

16.加入1 mL W5稀释并终止反应，100g离心2 min。

17.去除含有PEG4000的上清液，加入W5或Incubation Solution重新悬浮并置于用0.1% BSA浸泡过的塑料培养皿中培养。

18.原生质体在28℃，40rpm 暗培养12-16 hr后用激光共聚焦显微镜观察。

试剂配方：Enzyme solutionCellulase RS (Yakult)2%macerozyme R10 (Yakult)1%MES pH5.60.1%mannitol (fresh prepare)0.4 MHeat 55℃,10 min and cool at RTCaCl2.2H2O 0.1%0.45 μm Filter sterilizedW5 SolutionWorking Stock Add154 mM NaCl 3 M 10.3 mL125 mM CaCl2 1 M 25 mL5 mM KCl 0.2 M 5 mL2 mM MES (pH5.7) 0.1 M 4 mL5 mM glucose 0.1 M 10 mLAdd H2O final to 20 mLMMg SolutionWorking Stock Add0.4 M mannitol (fresh) 0.8 M 7.5 mL15 mM MgCl2 1 M 0.15 mLAdd H2O final to 200 mLPEG Solution (40%,V/V)Stock Final concentration PEG 4000 (Fluka,81240) 4 g 40%0.8 M mannitol 1.093 g 0.6 M1 M CaCl2 1 mL 0.1 MAdd H2O Final to 10 mL将PEG solution 与55 ℃水浴溶解，冷却后可进行转化Incubation Solution (10 mL)Working Stock Add0.6 M mannitol 0.8 M 7.5 mL4 mM MES pH5.7 0.1 M 0.4 mL4 mM KCl 0.2 M 0.2 mLAdd H2O 1.9 mL。

水稻花粉管通道法摘要水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。

本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。

一、引言水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。

为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。

其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。

二、原理花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。

在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。

此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。

三、技术流程1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。

2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。

3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。

4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。

5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。

四、优缺点1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。

此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。

2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。

此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。

五、应用前景随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。

未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。

同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。

水稻的培养: 水稻去壳后于75%的酒精中浸泡1 min，再用50%的次氯酸钠消毒30 min后，分别播种到1/2MS培养基培养基上，1.2.5 水稻原生质体转化实验水稻原生质体转化实验参照文献（Bart et al., 2006），具体做法如下:（1）水稻黄化苗培养。

将水稻种子（约100粒）去壳后消毒（参见上文），播种到1/2MS培养基上，黑暗条件下，28℃培养12 d。

（2）黄化苗的处理。

去除黄化苗的根和叶，将其茎切成1～2 mm的小段，放入含有15 mL酶解液的培养皿中。

（3）酶解液浸润水稻组织。

将培养皿盖打开，室温条件下,避光抽真空1 h，使酶解液浸润组织。

（4）酶解组织，释放细胞。

盖好培养皿盖，避光，25℃，40 rpm酶解组织4 h。

随后将转速调至80 rpm，释放细胞2 min。

（5）收集细胞。

向培养皿中加入等体积的W5溶液，轻轻混匀，经Miracloth 和millipore过滤组织残渣，并用2倍酶解液体积的W5溶液洗组织残渣3次，1500 rpm离心4 min，小心弃上清；加入10 mL W5溶液重悬细胞，1500 rpm离心4 min，小心弃上清。

（6）重悬细胞，确定细胞浓度。

加入一定体积的MMG溶液重悬细胞，用血球计数板确定细胞浓度，当细胞浓度达到106个/mL时即可用于原生质体转化。

（7）原生质体转化。

在2 mL的离心管中，按照表3加入相应的质粒DNA，200 uL的细胞悬浮液，220 uL的40% PEG，轻轻混匀，于25℃避光条件下孵育20 min。

加入1 mL的W5，轻轻混匀，终止反应，置于25℃培养箱中避光培养12 h。

（8）细胞裂解。

从培养箱中取出细胞悬浮液，2000 rpm离心5 min，弃上清。

加入200 ul的1×CCLR，涡旋振荡30 s后，2000 rpm离心5 min。

[生物]基因枪法转化水稻的研究进展的论文水稻(oryza sativa)是世界上最主要的粮食作物之一。

近年来，dna重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展，美国monsanto 公司2000年4月、syngenta 公司2001年2月先后宣告完成粳稻日本晴(nipponbare)基因组测序草图。

我国也已宣布完成籼稻9311的序列框架图。

目前以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究正在迅速发展，而这一研究之后必然是依托于高效的水稻遗传转化体系，因此水稻遗传转化研究越来越成为人们关注的焦点。

水稻遗传转化体系已比较完善，农杆菌介导法、基因枪法、peg法、花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。

禾谷类作物由于不是农杆菌的天然宿主，曾一度限制了农杆菌介导法转化水稻。

基因枪法由于其没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化，因而得到了很大的发展。

本文就基因枪法的基本原理及其优缺点、影响基因枪法转化水稻的几个关键因素、外源基因的遗传特性及存在的问题等方面作简要综述。

1 基因枪法的原理及优缺点基因枪法的原理基因枪法(paricle gun)又称微弹轰击法(micro- projecticle bombardment，particle bombardment，or biolistics)。

其基本原理是将外源dna包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源dna进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。

基因枪法的优、缺点基因枪法的优点(1)无宿主限制。

基因枪法本质上是一种物理过程，没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化。

以原生质体为受体的peg转化法、电击法、脂质介导转化法和显微注射法等虽然可以用于单子叶植物的转化，然而，以原生质体作为受体材料要求受体系统具有良好的再生性能，这对于大多数禾谷类作物来说是较困难的，而且其再生的周期比较长，再生过程容易产生变异。

转基因水稻简介水稻是世界上最重要的粮食作物之一，杂种优势的成功利用使得水稻产量得到了极大的提高，为解决世界范围内的粮食危机做出了极大的贡献。

但是，自20世纪80年代以来，杂交水稻的产量就处于徘徊不前的局面。

不断提高水稻产量和改良其品质是当前水稻育种的重要任务，这一任务的完成单纯依靠传统的遗传育种是不可能实现的。

80年代产生的转基因技术由于直接在基因水平上改造植物的遗传物质、可定向改造植物的遗传性状、外源基因的转入打破了物种之间的生殖隔离障碍、丰富了基因资源等优点而弥补了常规育种方法的不足，得到了前所未有的发展。

许多学者在水稻的转基因研究上做了大量工作并取得了很大的进展，为水稻的遗传改良奠定了基础。

转抗虫基因：害虫是危害我国农业生产的主要限制因素，大量化学农药的使用不但污染环境，而且也使得有益昆虫的数量锐减，害虫的抗药性不断加强。

此外，化学杀虫剂使用后的农药残留对人畜都会有严重的危害。

因而植物抗虫基因工程成为科学家的研究热点领域之一。

由于水稻本身没有足够的抗虫基因，目前研究者利用人工合成或从其它生物中克隆的抗虫基因转化到水稻栽培品种中，提高品种的抗虫性。

在水稻抗虫转基因方面，使用得较多的基因有：苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt)、蛋白酶抑制剂基因(Pin2，SKTI，OC—IAD86，Cp-Ti)、植物凝集素基因(GNA)等，将这些基因导入水稻，可使水稻产生对二化螟虫、三化螟虫、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫及蝗虫、褐飞虱、线虫的抗性。

Bt毒蛋白基因是目前使用最广的基因，众多的研究都表明用转基因的方法将Bt毒蛋白基因导入常规水稻可使水稻对螟虫的抗性提高刚。

转抗病基因：病害(包括真菌病、细菌病和病毒病)是影响我同农业生产的另一类重要限制因素。

在我国，大面积发生且危害严重的病害有水稻稻瘟病、纹枯病、白叶枯病，因此，我国科学家在抗病基因工程方面也开展了大量的工作。

转抗逆基因：逆境是限制植物生长、影响产量形成的重要因素之一。

水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。

现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。

本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。

或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。

注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。

制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。

通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。

质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。

单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。

放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。

使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。

40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。

3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。

）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。

（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。

）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。

植物原生质体以之全能性的优势被广泛运用于分子细胞生物学研究中，包括亚细胞定位检测、融合培育、瞬时表达体系建立、植物病毒粒体形态特征检测中的运用。

本文将对植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用以及优势与缺陷进行综述。

引言原生质体最早在1880年被提出，植物原生质体是指通过酶解或机械法的作用将植物细胞进行质壁分离后获得的细胞质。

植物原生质体具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力。

植物原生质体由于取出了细胞壁，通过采用外源添加物以及外源基因的处理后，能够快速产生反应、代谢以及反馈，被广泛运用于植物分子细胞生物学研究中，能够提高实验效率，并获得有效的体内实验相关数据。

植物原生质体在分析细胞生物学中开辟了崭新的领域，在植物的亚细胞定位检测、融合培训、瞬时表达体系建立、病毒粒体形态特征检测中得到了良好运用。

本文浅析了植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用，为利用植物原生质体进行植物的品种改良、培育等提供参考。

1 植物原生质体概述与动物细胞不同，植物细胞在细胞膜外还具有一层由纤维素、半纤维素和果胶组成的细胞壁。

细胞壁会阻碍细胞发生融合以及跨膜传递遗传物质。

植物原生质体就是由完整植物细胞（见图1）植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用段李枫（成都理工大学,四川 成都，610000）去掉细胞壁后的裸露球形细胞。

植物原生质体具有以下特点：（1）增强了吸收能力，能够更容易摄取外来遗传物质、氧气、养分、细菌、病毒等；（2）具有全能性，能够通过人工培养发育成完整植株；（3）能够在一定条件下通过诱导发生原生质体融合，进而形成杂种细胞；（4）增强了分泌能力，在去除细胞壁时，同时也消除了细胞壁存在是产生的扩散障碍，增强了细胞膜的透过性，有助于细胞内产物的分泌；（5）由于取出细胞壁后，失去了细胞壁的保护作用，导致植物原生质体的稳定性较差，容易受到外部条件变化的影响，如渗透压。

图1 完整植物细胞结构图作者简介：段李枫，1998年11月生，男，汉族，四川彭山人，毕业于成都理工大学，生物工程专业，研究方向：生物学。