固定液的选择原则
固定液的选择原则如下：
1. 根据待分离组分的性质选择。
（1）分离非极性物质时，一般选用非极性固定液。
（2）分离极性物质时，一般选用极性固定液。
（3）分离极性和非极性物质时，一般选用极性或氢键型固定液。
（4）分离能形成氢键的物质时，一般选用氢键型固定液。
（5）分离具有不同程度极性或氢键的物质时，一般选用能形成氢键型的混合固定液。
2. 根据流动相的性质选择。
（1）当流动相极性小于固定相极性时，对非极性物质具有良好的分离效果。（2）当流动相极性大于固定相极性时，对极性物质具有良好的分离效果。（3）当流动相中含有亲水性的离子或粒子时，对极性物质具有良好的分离效果。（4）当流动相中含有亲油性的分子或粒子时，对非极性物质具有良好的分离效果。
3. 根据分离模式选择。
（1）正相色谱：一般选用极性或氢键型固定液，对于极性较大的组分，可选用非极性固定液。
（2）反相色谱：一般选用非极性或中等极性的固定液，对于某些极性较大的组分，也可选用极性或氢键型固定液。
（3）离子色谱：一般选用离子交换型的固定液，根据所带电荷的性质选择合适的固定液。
（4）分子排阻色谱：一般选用凝胶型的固定液，根据分子尺寸的大小选择合适的固定液。
（5）疏水作用色谱：一般选用疏水型的固定液，根据疏水作用的强弱选择合适的固定液。
4. 根据实验条件和要求选择。
（1）对于需要高分辨率的分离，一般选用选择性较高的固定液。
（2）对于需要在较短时间内完成分离的，一般选用速度较快的固定液。
（3）对于需要在较高温度下进行分离的，一般选用高温稳定的固定液。（4）对于需要痕量分析的分离，一般选用灵敏度较高的固定液。
5. 注意保护环境：选择环保型的固定液，避免使用对环境不友好的有机溶剂作为固定液。
总之，在选择固定液时，需要根据待分离组分的性质、流动相的性质、分离模式、实验条件和要求以及环保因素综合考虑，以得到最优的分离效果。
色谱分析综合体 一．选择题 1．在色谱分析中，用于定量的参数是( B ) A 保留时间 B 调整保留值 C 峰面积 D 半峰宽 2．塔板理论不能用于( D ) A 塔板数计算 B 塔板高度计算 C 解释色谱流出曲线的形状 D 解释色谱流出曲线的宽度与哪些因素有关 3．在气-固色谱分析中, 色谱柱内装入的固定相为( D ) A 一般固体物质 B 载体 C 载体+固定液D固体吸附 剂 4．当载气线速越小，范式方程中，分子扩散项B越大，所以应选下列气体中哪一种 作载气最有利？( D ) A H2 B He C Ar D N2 5．试指出下述说法中, 哪一种是错误的? ( C ) A 根据色谱峰的保留时间可以进行定性分析 B 根据色谱峰的面积可 以进行定量分析 C 色谱图上峰的个数一定等于试样中的组分数 D 色谱峰的区域宽度 体现了组分在柱中的运动情况 6．为测定某组分的保留指数，气相色谱法一般采取的基准物是：( C ) A 苯 B 正庚烷 C 正构烷烃 D 正丁烷和丁二 烯 7．试指出下列说法中，哪一个不正确？气相色谱法常用的载气是（ C ） A N2 B H2 C O2 D He 8．试指出下列说法中，哪一个是错误的？（ A ） A 固定液是气相色谱法固定相 B N2、H2等是气相色谱流动相
C 气相色谱法主要用来分离沸点低，热稳定性好的物质 D 气相色谱法是一个分离效能高，分析速度快的分析方法 9． 在气-液色谱法中, 首先流出色谱柱的组分是 ( A ) A 溶解能力小 B 吸附能力小 C 溶解能力大 D 吸附能力大 10．根据范第姆特议程式，指出下面哪种说法是正确的？ （ A ） A 最佳流速时，塔板高度最小 B 最佳流速时，塔板高度最大 C 最佳塔板高度时，流速最小 D 最佳塔板高度时，流速最大 二．填空题 1．按流动相的物态可将色谱法分为 气相色谱法 和 液相色谱法 。前者的流动相的 气体 ，后者的流动相为 液体 。 2．气相色谱法多用 高 沸点的 有机 化合物涂渍在惰性载体上作为固定相，一般只要在 450 ℃以下，有 1.5 至 10 Kp a 的蒸气压且 稳定 性好的 有机和 无机 化合物都可用气相色谱法进行分离。 3．气相色谱仪由如下五个系统构成：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统和检测记录系统。 4．气相色谱常用的检测器有 热导检测器 ， 氢火焰检测器 ， 电子捕获检测器 和 火焰光度检测器 。 三、简答题 1、组分A 、B 在某气液色谱柱上的分配系数分别为495和467。试问在分离时哪个组分先流出色谱柱。 答：根据分配系数的定义： g s c c K = 分配系数小的组分先流出色谱柱，因此B 先流出色谱柱。 2、为什么说分离度R 可以作为色谱柱的总分离效能指标？ 答：由 )2()1()1()2()2()1() 1()2()(2)(21b b R R b b R R W W t t W W t t R +-=+-= 及1,21,2)2(') 1(')2(144r r n t t t n R eff R R R eff -?=-?= 可知 R 值越大，相邻两组分分离越 好。而R 值的大小则与两组分保留值和峰的宽度有关。对于某一色谱柱来说，两组分保留值差别的大小主要取决于固定液的热力学性质，反映了柱选择性的好坏；
常用固定液及其配制 固定液分单纯固定液和混合固定液。 1甲醛（formaldehyde） 是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。 10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。 经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2 乙醇 无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。 3 中性甲醛液（混合固定液） 甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。 4 AF液（混合固定液） 95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。 此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。 以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。 yzbai wrote: （1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。 （2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
影响因素： 第三章气相色谱法 1. 当只要色谱柱的塔板数足够多，任何两物质都能被分离吗？ 答：错误的。根据塔板理论，单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。塔板理论给出了衡量色谱柱分离效能的指标，但柱效并不能表示被分离组分的实际组分的世纪分离效果，因为两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大都无法实现分离。 2. 气相色谱中，固定液选择的基本原则是什么？如何判断化合物的出峰顺序？ 答：固定液选择的基本原则是：①挥发性小②热稳定性好③熔点不能太高④对试样中的各组分有适当的溶解能力⑤化学稳定性好，不与试样发生不可逆化学反应⑥有合适的溶剂溶解。如何判断化合物的出峰顺序？ 答：①分离非极性组分时，通常选用非极性固体相，各组分按照沸点顺序出峰，低沸点组分先出峰②分离极性组分时，一般选用极性固定液，各组分按照极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。 解答题 1.为什么离子选择性电极对欲测电子具有选择性？如何估量这种选择性？ 答：离子选择性电极是以电位测量溶液中某些特定离子活度的指示电极。各种离子选择性电极一般均由敏感膜极其支持体，内参比电极，内参比溶液组成，其电极电位产生的机制都是基于内部溶液与外部溶液活度不同而产生的电位差。起核心部分是敏感膜，它主要对欲测电子有响应，而对其他离子则无响应或者响应很小，因此每一种离子选择性电极都具有一定的选择性。而估量这种选择性可用离子选择性电极的选择性系数来估量其选择性。 2.何为分析线对？在光谱定量分析中选择内标元素及分析线对的原则是什么？ 答：在被测元素的光谱中选择一条作为分析线(强度为I)，在选择内标物的一条谱线（强度为I0），组成分析线对。选择原则：①内标元素含量一定②内标元素与被测元素在光源作用下应有相近的蒸发性质③分析线对应匹配，同为原子线或者离子线，且激发电位相近，形成“匀称线对”。④分析线对波长应尽可能接近，分析线对的两条谱线应没有自吸或自吸很小，并且不受其他谱线干扰。 3.气相色谱定量的方法主要有哪几种？各适合什么条件下使用？ 答：归一化法：所有组分都出峰，且面积都能准确测定出来。 内标法：适合只测几种成分或个别组分不出峰。 外标法：有标样各种样品，要求准确进样。 4.影响红外光谱中基因频率的主要因素有哪些？答：外部因素：样品状态制样 方法 内部因素：⑴诱导效应共轭效应中介效应⑵环张力效应⑶氢键效应⑷振动的偶合效应。 5.为什么原子吸收光谱为线状光谱？紫外可见分子吸收光谱为带状光谱？ 答：原子吸收光谱为原子外层电子发生能级跃迁时产生的，是量子化的，因而
几种细胞固定方法 选择最佳固定液标准是： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的； （3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光； （4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。 单纯固定液 （1）4%中性甲醛固定液： 最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。中性甲醛是以的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。 （2）乙醇固定液： 使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。 （3）4%多聚甲醛固定液： 主要用于培养细胞的固定。 混合固定液 （1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液： 适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。 （2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液： 多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。 （3）Bouin固定液： 非凡适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。 （4）Carnoy固定液： 穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。 （5） Zenker固定液： 经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
中性甲醛固定液的配置 免疫组化技术的关键问题 1.组织处理 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。 组织及时取材 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h 内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。) x! R; ^" s) 2、固定
固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的4倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。 对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。 1）4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）：该固定液适用于免疫组织化学方法。动物先用此液进行灌注固定，取材后，再 用该液浸泡固定2-24h。
一些固定液及方法介绍 前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4?2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin's液及改良Bouin's液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin's液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamboni's(Stefanini's)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸150ml Karasson-Schwlt's PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt's PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt's磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其
固定液的选择原则 固定液的选择原则如下： 1. 根据待分离组分的性质选择。 （1）分离非极性物质时，一般选用非极性固定液。 （2）分离极性物质时，一般选用极性固定液。 （3）分离极性和非极性物质时，一般选用极性或氢键型固定液。 （4）分离能形成氢键的物质时，一般选用氢键型固定液。 （5）分离具有不同程度极性或氢键的物质时，一般选用能形成氢键型的混合固定液。 2. 根据流动相的性质选择。 （1）当流动相极性小于固定相极性时，对非极性物质具有良好的分离效果。（2）当流动相极性大于固定相极性时，对极性物质具有良好的分离效果。（3）当流动相中含有亲水性的离子或粒子时，对极性物质具有良好的分离效果。（4）当流动相中含有亲油性的分子或粒子时，对非极性物质具有良好的分离效果。 3. 根据分离模式选择。 （1）正相色谱：一般选用极性或氢键型固定液，对于极性较大的组分，可选用非极性固定液。 （2）反相色谱：一般选用非极性或中等极性的固定液，对于某些极性较大的组分，也可选用极性或氢键型固定液。 （3）离子色谱：一般选用离子交换型的固定液，根据所带电荷的性质选择合适的固定液。 （4）分子排阻色谱：一般选用凝胶型的固定液，根据分子尺寸的大小选择合适的固定液。 （5）疏水作用色谱：一般选用疏水型的固定液，根据疏水作用的强弱选择合适的固定液。 4. 根据实验条件和要求选择。 （1）对于需要高分辨率的分离，一般选用选择性较高的固定液。 （2）对于需要在较短时间内完成分离的，一般选用速度较快的固定液。
（3）对于需要在较高温度下进行分离的，一般选用高温稳定的固定液。（4）对于需要痕量分析的分离，一般选用灵敏度较高的固定液。 5. 注意保护环境：选择环保型的固定液，避免使用对环境不友好的有机溶剂作为固定液。 总之，在选择固定液时，需要根据待分离组分的性质、流动相的性质、分离模式、实验条件和要求以及环保因素综合考虑，以得到最优的分离效果。
之前交的作业 固定液的选择总原则：“相似相溶” (1) 分离非极性组分时 通常选用非极性固定相。各组分按沸点顺序出峰,低沸点组分先出峰。 (2) 分离极性组分时 一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。 (3) 分离非极性和极性的混合物 一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。 担体的作用 气相色谱达到完全分离时的分离度，达到98%分离时的分离度 影响高效液相色谱峰扩展的因素及可忽略因素 气相色谱检测器根据响应原理的不同可分为浓度型检测器和质量型检测器两类。浓度型检测器：如热导池检测器（TCD） 质量型检测器，如氢火焰离子化检测器（FID） HPLC与GC差别：分析对象的区别；流动相的区别；操作条件差别 提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。 液固吸附色谱法：影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，t R↑ 溶剂分子极性↑，洗脱能力↑，k↓，t R↓ 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异； 正相色谱——固定液极性 >流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ?适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ?适于分离非极性组分 化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检侧系统、记录及数据处理系统 影响原子吸收光谱谱线变宽的几个因素 原子吸收光谱光源作用 空心阴极灯优缺点 原子化系统作用 富燃火焰（燃助比大于计量比）还原性火焰；贫燃火焰（燃助比小于计量比）氧化性气氛 原子化过程分为干燥、灰化（去除基体）、原子化、净化（去除残渣）四个阶段，待测元素在高温下生成基态原子。 原子吸收光谱法分析中的干扰主要包括物理干扰、化学干扰、电离干扰和光谱干扰 （1）消电离剂—-为了克服电离干扰一方面可以控制火焰温度，另一方面可以加入大量的易电离元素以抑制待测元素的电离。
色谱分析综合体 填空： 1. 氢火焰离子化检测器和热导池检测器分别属于_质量型__和___浓度__型检测器。气相色谱仪的心脏是_色谱柱___。 2. 固定液一般是按照__相似相溶___原理选择；在用极性固定液分离极性组分时，分子间作用力主要是__诱导力____，极性愈大，保留时间就愈___长__。 3. 固定液通常是高沸点的有机化合物，这主要是为了保证固定液在使用温度下有____较好的热稳定性____，防止___发生不可逆的化学反应____。 4. 用于气液色谱的担体主要分为____白色担体___、___红色担体___两类。 5. 与填充柱相比，毛细管色谱柱的相比β较大，有利于实现快速分析。但其柱容量_较小_。 6. 在HPLC仪中，为了克服流动相流经色谱柱时受到的阻力，要安装_耐高压的六通阀___。 7. 气相色谱分析中，载气仅起输送作用；而液相色谱分析中，流动相还要直接参加__实际的分配过程__，要想提高高效液相色谱的柱效，最有效的途径是__使用小粒径填料_。 8. 欲分离位置异构体化合物，宜采用的高效液相色谱的分离模式是__梯度洗脱___。 9、色谱法中，将填入玻璃管内静止不动的一相称为固定相，自上而下运动的 一相称为流动相，装有固定相的柱子称为色谱柱。 10、液相色谱检测器一般可用紫外可见分光光度检测器，荧光检测器；气相色谱检测器可用热导检测器，氢火焰离子检测器，电子俘获检测器等。 色谱学分析基础： 1、色谱定性的方法都有哪些？ 答、(1) 用保留时间定性(2) 用相对值保留定性(3) 用保留指数定性(4)用化学反应配合色谱定性 (5)用不同类型的检测器定性⑹色谱和各种光谱或波谱联用 2、内标法定量分析时，内标物选择应满足那些条件？ 答：①试样中不含有该物质②与被测组分性质比较接近③不与试样发生化学反应④出峰位置应位于被测组分接近，且无组分峰影响 气相色谱 6. 对载体和固定液的要求分别是什么? 答：载体要求:①具有化学惰性②好的热稳定性③有一定的机械强度④有适当的比表面，表面无深沟，以便是固定液成为均匀的薄膜，要有较大的空隙率，以便减小柱压降。对固定液的要求：应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应。 固定液的选择原则：①“相似相容”原则，②固定液和被分离物分子之间的特殊作用力，③利用混合物固定液④利用协同效应选择固定液 10．假设一个未知油剂样品，请设计一种气象色谱分析方法，并概述分析过程。 液相色谱： 11、正相HPLC与反相HPLC的主要不同之处什么？各适合分离什么物质？ 答：正相HPLC是指以亲水性的填料做固定相，以疏水性溶剂或混合物做流
固定液的分类和选择原则 以固定液的分类和选择原则为标题，我们来探讨一下固定液的相关知识。 一、固定液的分类 固定液是一种用于固定生物组织或细胞的溶液，根据不同的固定目的和化学成分，可以将固定液分为以下几类： 1. 醇类固定液：如乙醇、甲醇等。这类固定液常用于快速固定和保存细胞和组织的形态结构，同时具有很好的保护作用，适用于常规组织学检查。 2. 酸类固定液：如酸性酒精、酸性硫酸铜等。这类固定液主要用于固定某些特定的细胞或组织结构，例如染色体或胶原纤维等。酸类固定液对脂质物质的固定效果较差，因此不适用于脂质含量较高的样本。 3. 中性缓冲液：如PBS（磷酸盐缓冲液）、Hank's液等。这类固定液主要用于固定细胞和组织的生物学活性，能够较好地保持细胞和组织的形态和功能，适用于免疫组化和分子生物学实验。 4. 有机溶剂固定液：如乙酸、乙酸乙酯等。这类固定液在固定过程中对细胞和组织的脂质物质和溶胀性物质具有较好的固定效果，适用于脂质或溶胀性物质含量较高的样本。
二、固定液的选择原则 在选择固定液时，我们需要考虑以下几个原则： 1. 根据固定目的选择：不同的实验目的需要选择不同的固定液。例如，要观察细胞形态结构，可以选择醇类固定液；要进行免疫组化实验，可以选择中性缓冲液。 2. 根据样本性质选择：不同的样本性质对固定液的选择有所差异。例如，脂质含量较高的样本适合选择有机溶剂固定液；而含有胶原纤维的样本可以选择酸类固定液。 3. 考虑固定液的渗透性：固定液的渗透性对于固定效果至关重要。一般来说，较强的渗透性可以提高固定效果，但同时也可能对细胞或组织的形态和功能产生一定影响。因此，需要根据具体实验要求选择合适的固定液。 4. 考虑固定液的毒性和安全性：固定液中可能含有一些有毒物质，因此在选择固定液时，需要考虑其对实验人员和环境的安全性。同时，在实验过程中也要注意安全操作，避免接触到固定液。 总结： 固定液的分类和选择原则是进行组织学和细胞学研究中非常重要的一环。通过根据不同固定目的和样本性质的选择，以及考虑固定液的渗透性和安全性等因素，可以得到较好的固定效果，保证实验结
气相色谱柱常用的固定液 一、非极性 1、100%Dimethyl polysiloxane，100%聚二甲基硅氧烷，商品名：AC1，OV-101，OV-1，DB-1，SE-30，HP-1，RTX-1，BP-1 二、弱极性 2、5%Phenyl dimethyl polysiloxane, 5%二苯基(95%)二甲基聚硅氧烷，商品名：AC5，SE-52， 3、5% Phenyl 1%vinyl dimethyl polysiloxane，5%二苯基1%乙烯基(94%)二甲基聚硅氧烷，商品名：OV-5，DB-5，SE-54，HP-5，RTX-5，BP-5 注：2、3常无严格区分，通常混称。 三、中等极性 4、50%Phenyl dimethyl polysiloxane, 50%二苯基(50%)二甲基聚硅氧烷，商品名：OV-17，HP-50，RTX-50 5、14%Cyanopropyl phenyl polysiloxane, 14%氰丙基苯基(其中7%氰丙基7%苯基)(86%)二甲基聚硅氧烷，商品名：AC10，OV-1701，DB-1701，RTX-1701 6、50% Cyanopropyl phenyl polysiloxane，50%氰丙基苯基(其中25%氰丙基25%苯基)(50%)二甲基聚硅氧烷，商品名：AC225，OV-225，BP-225，DB-225，HP-225，RTX-225 四、强极性 7、polyethylene glycol,聚乙二醇，商品名：AC20，PEG20M，HP-INNOWAX(FFAP是其与2-硝基对苯二甲酸的反应产物) 常用毛细管色谱柱对应表 SE-30、OV-1，化学组成：100%甲基聚硅氧烷（胶体），所属极性：非极性，适用范围：碳氢化合物、农药、酚、胺，对照牌号：DB-1、BP-1、007-1、SPB-1 、RSL-150、CPSRL-5 、HP-1. OV-101,化学组成：100%甲基聚硅氧烷（流体）,所属极性：非极性,适用范围：氨基酸、碳氢化合物、药物胺,对照牌号：HP-100、SP-2100 SE-52、SE-54,化学组成：5%苯基聚硅氧烷、1%乙烯基5%苯基甲基聚硅氧烷,所属极性：弱极性,适用范围：多核芳烃、酚、酯、碳氢化合物、药物胺,对照牌号：DB-5 、BP-5、SPB-5、007-2 、OV-73、CPSIL-8、RSL-120 、HP-5.
选择固定液的基本规则 在选择固定液时有几项最基本的原则可以遵循，利用这些基本原则可以减少试验量，节约时间和精力。1．相似相溶原则 这一原则是人们研究物质溶解过程时总结出来的规律，即溶质和溶剂在极性、官能团和化学性质等相似时，可以相互溶解。在研究气相色谱固定液和被分离物质之间的作用时，也应用了这一原理，即被分离物质和固定液的极性、结构、官能团相似时，二者的作用力强，保留时间就长。在分离同类型的混合物时只要他们的沸点有差别，使用和样品相同类型的固定液就可以得到良好的分离。但是该原则不是在任何情况下都有效的，几不能不考虑具体情况一概使用“极性混合物用极性固定液进行分离，非极性混合物用非极性固定液进行分离”的规律。例如分离苯和环己烷时使用非极性固定液反而不好，而使用极性固定液就可以把二者分开。一般来说，在同系物或相同官能团的混合物组分在沸点上有差别时，使用相似相溶原则有效。 2．固定液和被分离物分子间的特殊作用力 所谓特殊作用力是指除色散以外的几种作用力，利用固定液和被分离物分子之间的特殊作用力是选择固定液十分重要的原则。 （1）利用固定液的诱导力 如果难分离物质对中，一个是难极化的非极性化合物，而另一个是易极化的非极性化合物，二者沸点又相近，这时候不能利用沸点差别进行分离，而要用极性强的固定液分离它们。强极性固定液可以是易极化的非极性化合物产生诱导力，从而增强它们之间的作用力，是保留时间加长，这样一来就可以把二者分离开。例如在非极性固定液上苯和环己烷不能分离，而在β，β-氧二丙腈上却可以十分容易的分离。 （2）利用固定液的氢键力 氢键力在气相色谱中有着十分重要的作用，利用氢键力的差别选择固定液十分有效。例如二甲胺和三甲胺的分离就是*氢键力的不同，二甲胺为仲胺，在氮原子上留有一个活泼氢原子，有给质子的能力，也就是说二甲胺分子上的氮可以受质子，氮上的氢可以给质子，遇到氢键型固定液就有双重的作用力；而三甲胺分子上的氮没有氢，只是氮原子可以受质子，它和氢键型固定液的作用力不如二甲胺，因而保留时间就低于二甲胺。二甲胺和三甲胺在甘油固定液上可以得到很好的分离。。二甲胺和三甲胺在甘油固定液上可以得到很好的分离。 （3）利用固定液的受质子力 有一些固定液，如邻苯二甲酸二酯类，它们具有受质子能力较强的特点，对于一些给质子力强的化合物有较强的保留能力。如在DNP上氟里昂F23和F13可以分开，而在非极性DC-703固定液上不能分离。 （4）利用固定液的给质子力 给质子力强的固定液，容易和受质子的化合物形成氢键，例如用QF-1固定液分离沸点相近的甲乙酮和乙醇，由于QF-1和甲乙酮的羰基有很强的作用力，乙醇在甲乙酮之后出峰。 （5）利用形成超分子的固定液 超分子化学（supramolecular chemistry）的概念是：“超出单个分子的化学”，“按照需要形状设计出的分子进行分子间相互作用的化学”。因而超分子化学对研究色谱的分离的机理以及设计特殊选择性分离介质具有重要的指导意义。分子与分子之间的相互作用，特别是由于主客体分子之间的选择性很强的相互作用是超分子化学的核心，这一点也正是色谱分离问题的关键所在。所以色谱科学和超分子化学存在着密不可分的关系。固定液的选择可以充分利用它。 3．利用混合固定液 在分离三种以上组分的混合物时，常常发现这样的现象，即在某一种固定液上有一对物质分离不开，而在另一种固定液上这一对物质可以分离，但又有另外一对物质重叠，但是如果把这两种固定液以某
气液色谱固定相对于固定液的要求是指在气液色谱过程中，用作固定 相的物质对于固定液的要求。气液色谱是一种高效、精密的分析技术，其分离效果和分析准确性直接受固定相的影响。固定相对于固定液的 要求至关重要。 1. 清洁度 在气液色谱中，固定相的清洁度是至关重要的。固定相必须要求具有 较高的纯度，不含杂质，避免在色谱分析过程中对样品产生干扰。固 定相的选择要求必须是清洁的。 2. 稳定性 固定相对于固定液的要求还包括其稳定性。在色谱分析过程中，固定 相应该是稳定的，要能够在一定的温度和压力下保持其特性不变。这 样才能够保证色谱分离的准确性和重现性。 3. 选择性 固定相对于固定液的要求还包括其选择性。固定相应该具有良好的选 择性，能够对不同成分具有较好的分离效果。只有具有良好的选择性 的固定相才能够适用于不同的色谱分析。 4. 适应性 固定相对于固定液的要求还包括其适应性。固定相必须要求能够适应 不同的分析条件和样品特性，具有一定的通用性和灵活性。
气液色谱固定相对于固定液的要求是多方面的，需要具备清洁度、稳定性、选择性和适应性。只有具备这些要求的固定相才能够保证色谱分析的准确性和可靠性。 在我看来，气液色谱固定相对于固定液的要求是非常重要的，它直接影响了色谱分析的结果。在选择固定相时，需要根据实际分析的样品和情况来综合考虑其清洁度、稳定性、选择性和适应性。只有这样才能够确保色谱分析的精确性和可靠性。气液色谱固定相对于固定液的要求是色谱分析中至关重要的一环。固定相的选择将直接影响到色谱分离的效果和分析结果的准确性，因此需求具备一定的特性来满足实际分析的需要。 固定相的清洁度是非常重要的。清洁的固定相能够避免杂质对样品的干扰，保证色谱分析结果的准确性。在选择固定相的时候，需要考虑其纯度和是否具有良好的清洁性能。一般来说，固定相的生产厂家通常会对固定相进行严格的纯度检测和清洁处理，以确保固定相的清洁度符合要求。 固定相的稳定性也是至关重要的。在色谱分析过程中，固定相需要能够在一定的温度和压力下保持其特性不变，以确保色谱分离的准确性和重现性。固定相的稳定性是固定相对于固定液的另一个重要要求。目前市面上的气液色谱固定相通常会标注其使用温度和压力范围，以
气液色谱法（Gas-liquid chromatography, GLC）是一种重要的色谱分析技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域中。在气液色谱法中，固定液的选择对色谱分离的效果至关重要。固定液的种类和性质会直 接影响到样品在色谱柱中的分离程度和分辨率。选择适合的固定液是 气液色谱法分析中的关键步骤。 1. 溶解性 固定液的溶解性是选择的基本原则之一。对于非极性物质，应选用非 极性的固定液，例如聚二甲基硅氧烷。对于极性物质，则需要选择相 应极性的固定液，例如聚乙二醇等。固定液与分析物的溶解性一致， 有利于提高分离效果。 2. 热稳定性 固定液在色谱分析过程中需要具有良好的热稳定性。色谱柱在运行过 程中会受到高温的影响，如果固定液不具备足够的热稳定性，就会导 致固定液分解或挥发，从而影响分离过程，甚至损坏色谱柱。 3. 吸附性能 固定液的吸附性能决定了其对样品分子的亲和力。通常情况下，固定 液的吸附性应该低于色谱柱填料，以避免固定液对样品的过度吸附， 导致分离不完全或峰形变形。 4. 选择性
固定液的选择性是指固定液对不同样品分子的选择亲和性。固定液的 选择性应该能够兼顾到需要分离的目标分子，既要有足够的与目标分 子相亲和性，又要避免对其他杂质分子的吸附。 5. 粘度 固定液的粘度对于色谱分析也是一个重要考虑因素。固定液的粘度适中，可以确保在色谱柱中的均匀涂覆，并使得色谱柱内的流动速度均匀，有利于色谱分离的进行。 总结回顾： 在气液色谱法中，选择合适的固定液是确保色谱分离效果的关键步骤。固定液的选择应考虑溶解性、热稳定性、吸附性能、选择性和粘度等 因素。只有在这些基本原则的基础上，才能够进行有效的气液色谱分离。 个人观点： 固定液的选择影响了气液色谱分析的结果，是非常重要的。在实际的 分析过程中，我们需要综合考虑样品的性质、分离的要求以及固定液 的特性，谨慎选择合适的固定液，以达到最佳的色谱分离效果。我建 议在实际操作中，应充分了解固定液的性质和特点，以确保色谱分析 的准确性和可靠性。 通过以上讨论，我们对气液色谱法中固定液选择的基本原则有了全面
标本组织固定液的选择和方法 病理组织学常用制备技术 组织的固定 （一）固定的概念 应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定（fixation）。 病理标本（样本）离体后，由于微环境的变化将发生自溶和（或）***，使其结构破坏。固定的目的和机制是：①使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，防止自溶，保存组织、细胞的离体前结构状态，包括保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。②保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病理性蓄积物，维持病变的特异性特征。③使上述物质转为不溶解状态，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。④起助染作用。 固定方法有：①物理学方法，如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。 固定应在标本离体后尽快进行，小标本可在取材后直接放入固定液内，大标本应在手术结束前或结束后迅速放入固定液内。 固定液与标本的比例不得少于标本体积得5倍。有特殊要求者应事先选定相应得固定液，如欲查糖原，应选择无水乙醇作固定液等。 固定得时间应适当，微小标本（如胃粘膜等）2～4h即可，大标本应置放12～24h，但亦不要过久，以免影响抗原性，造成免疫组化操作中得困难。
（二）常用固定液及其配制 固定液分单纯固定液和混合固定液。 1甲醛（formaldehyde） 是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。 10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。 经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2 乙醇 无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。 3 中性甲醛液（混合固定液） 甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。 4 AF液（混合固定液）
色谱分析综合体 填空： 1.氢火焰离子化检测器和热导池检测器分别属于_质量型__和___温度__型检测器。气相色谱仪的心脏是_色谱柱___。 2.固定液一般是按照__相似相溶___原理选择；在用极性固定液分离极性组分时，分子间作用力主要是 ___________ __诱导力，极性愈大，保留时 间就愈___ 长__。 3.固定液通常是高沸点的有机化合物，这主要是为了保证固定液在使用温度下有____ 较好的热稳定性__ ，防止___发生不可逆的化学反应____ 。 5.与填充柱相比，毛细管色谱柱的相比β 较大，有利于实现快速分析。但其柱容量_较小_。 6.在HPLC仪中，为了克服流动相流经色谱柱时受到的阻力，要安装_耐高压的六通阀___ 。 7.气相色谱分析中，载气仅起输送作用；而液相色谱分析中，流动相还要直接参加__实际的分配过程__，要想提高高效液相色谱的柱效，最有效的途径是__使用小粒径填料_。 8.欲分离位置异构体化合物，宜采用的高效液相色谱的分离模式是__梯度洗脱___。 9、色谱法中，将填入玻璃管内静止不动的一相称为固定相，自上而下运动的一相称为流动相，装有固定相的柱子称为色谱柱。 10、液相色谱检测器一般可用紫外可见分光光度检测器，荧光检测器；气相色谱检测器可用热导检测器，氢火焰离子检测器，电子俘获检测器等。 色谱学分析基础： 1、色谱塔板理论的假设？ 答、(1) 在每一个平衡过程间隔内, 平衡可以迅速达到；(2) 将载气看作成脉动(间歇)过程；(3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。(5) 所有的物质在开始时全部进入零号塔板 2、色谱定性的方法都有哪些？ 答、(1) 用保留时间定性(2) 用相对值保留定性(3) 用保留指数定性(4) 用化学反应配合色谱定性(5) 用不同类型的检测器定性⑹色谱和各种光谱或波谱联用 3、内标法定量分析时，内标物选择应满足那些条件？答：①试样中不含有该物质②与被测组分性质比较接近③不与试样发生化学反应④ 出峰位置应位于被测组分接近，且无组分峰影响 4、色谱分析中，固定相的选择原则是什么？固定相的选择：气－液色谱，应根据“相似相溶”的原则 5、色谱定量分析中为什么要用校正因子？在什么情况下可以不用? 答：各种化合物在不同的检测器上都有不同的应答值，所以尽管往色谱仪中注入相同质量的物质，但得到峰面积却不一样，因此峰面积定量时就必须把由色谱仪上得到的峰面积乘上一个系数，得到此成分的质量，在实际分析中，常用某物质做标准，得到一个相对的校正系数，就叫‘相对校正因子' 试样中不是所有组分 6、总结色谱法的优点。 答：色谱法特点( 1)分离效率高( 2) 灵敏度高( 3) 分析速度快( 4) 应用范围广⑸样品用量少⑹分离和测定一次完成⑺易于自动化，可在工业流程中使用 7、色谱流出曲线可解决的问题有哪些？ 8、根据你所学知识，填写下表。 气相色谱 1.气相色谱的基本设备包括那几部分, 各有什么作用? 载气系统去除载气中的水、有机物等杂质进样装置：色谱柱：色谱仪的核心部件 检测系统 2．试以塔极高度H 做指标讨论气相色谱操作条件的选择。 3.试述速率方程式中A、B、C 三项的物理意义。 答：A、涡流扩散项B、纵向扩散项C、传质阻力项 4.为什么可用分辨率R 作为色谱柱的总分离效能指标。 5.能否根据理论塔板数来判断分离的可能性？为什么？ 6.对载体和固定液的要求分别是什么? 答：载体要求: ①具有化学惰性②好的热稳定性③有一定的机械强度④有适当的比表面，表面无深沟，以便是固定液成为均匀的薄膜，要有较大的空隙率，以便减小柱压降。对固定液的要求：应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应。 7.试比较红色担体和白色担体的性能, 它们各使用在哪些方面? 答；红色担体适宜分析非极性化合物；白色单体适宜分析极性化合物； 8.固定液可分为哪几类？为什么这样划分？如何选择固定液。答：固定液按分子作用力分为①不易极化非极性固定液②易极化非极性固定液 ③难成氢键的极性固定液④受质子的极性固定液按极性分类用典型化合物在固定液上的保留性能来表征固定液的选择原则：①“相似相容”原则，②固定液和被分离物分子之间的特殊作用力，③利用混合物固定液④利用协同效应选择 固定液 9.色谱定性的依据是什么，主要有哪些定性方法。
1、色谱分析法 色谱法是一种分离分析方法。它利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交换等性能上的差异)，先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法。 2、色谱法的分离原理当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中固定相发生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱不同，在同一推动力作用下，各组分在固定相中的滞留时间不同，从而使混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。 3、流动相色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。 4、固定相色谱分离过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。 5、色谱法的特点(1)分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体。 (2)灵敏度高，可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 (3)分析速度快，一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。(4)应用范围广，气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。(5)
高选择性:对性质极为相似的组分有很强的分离能力。 6、色谱分析法的分类按两相状态分类，按操作形式分类，按分离原理分类。 7、按两相状态分类气相色谱(Gas Chromatography, GC)，液相色谱(Liquid Chromatography, LC)，超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。气相色谱：流动相为气体(称为载气)。常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体，按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱;按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱。液相色谱：流动相为液体(也称为淋洗液)。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。超临界流体色谱：流动相为超临界流体。超临界流体是一种介于气体和液体之间的状态。超临界流体色谱法是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分 析技术，不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。8、按操作形式分类柱色谱(Column Chromatography, CC):固定相装在柱管内;包括填充柱色谱和毛细管柱色谱。纸色谱(Paper Chromatography, PC)固定相为滤纸;采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离。薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相压成或涂成薄层;操作方法同纸色谱。