·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2013年第2期
1981年美国俄勒冈大学著名遗传学家George Streisinger 在《Nature》杂志上发表关于斑马鱼人工雌核发育的研究论文，标志着斑马鱼开始进入实验室模式生物研究领域，至今已有超过30年的历史。20世纪90年代中国开始参与斑马鱼研究。近几年，随着斑马鱼模式生物南方中心、北方中心和国家种质资源库相继成立，中国斑马鱼研究也开始进入高速发展阶段。由于体积小、代时短、胚胎透明、体外发育等特点，斑马鱼在模式生物研究中的地位越来越重要。随着显微注射、重组体构建以及荧光标记等技术的快速发展，转基因斑马鱼已经广泛用于脊椎动物基因表达调控、发育分化、形态发生、人类疾病、药物筛选和环境检测等研究领域。本文将
收稿日期：2012-07-20基金项目： 中国高技术研究发展“863”计划（2008AA10Z402），国家自然科学基金项目（31170119），中国农业科学院基础研究基金项目
（0042011006，0042012003）
作者简介：刘丽丽，女，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E -mail ：lilyinmay@ 通讯作者：闫艳春，女，博士，教授，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E -mail ：yanyanchun@
斑马鱼在转基因动物研究中的应用
刘丽丽 王健 吴巍 王海胜 闫艳春
（中国农业科学院研究生院，北京 100081）
摘 要： 近年来的研究表明，脊椎动物斑马鱼已发展成为一种十分重要的模式生物，在基因表达调控、发育与分化、形态发生、发病机理、药物筛选和环境检测等诸多研究领域都有重要的应用价值。在回顾模式生物应用与发展的基础上，着重概述斑马鱼作为模式生物的优越性、斑马鱼转基因技术的发展现状、转基因斑马鱼的应用领域，并提出斑马鱼转基因技术进一步发展可能面临的问题。
关键词： 模式生物 斑马鱼 Danio rerio 转基因动物 应用
Application of Zebrafish in Research of Transgenic Organisms
Liu Lili Wang Jian Wu Wei Wang Haisheng Yan Yanchun
（Graduate School of Chinese Academy of Agracultural Sciences ，Beijing 100081）
Abstract: The recent explosion of transgenic zebrafish lines in the literature demonstrates the value of this model system for detailed in vivo analysis of gene regulation, development and differentiation and morphogenetic movements, as well as drug screening and environment monitoring. After an outline of the application and development history of vital models from Escherichia coli to Musmusculus , the superiority of zebrafish as a model organism will be emphasized. Then this article will review the development history of transgenic technology in zebrafish and the uses of transgenic zebrafish. And finally problems in future development of transgenic zebrafish will be presented.
Key words: Model organism Zebrafish Danio rerio Transgenic animal Application
就斑马鱼在转基因动物研究中的应用进行介绍，并对该领域存在的问题进行总结。
1 常见模式生物
1.1 模式生物的发展历史
模式生物（model organism）能够代表一类生物的基本特点，结构相对简单并易于进行试验操作，因此普遍用于遗传学、发育生物学、生理学和分子细胞学等方面的研究。其普遍特点是：首先，生理特征能够代表生物界的某一大类群；其次，试验材料容易获得，并易于在实验室内饲养、繁殖速度快，研究维持费用低；最后，容易进行试验操作，特别是遗传学分析［1］。一般认为模式生物的应用源于格
生物技术通报Biotechnology Bulletin2013年第2期16
里高·约翰·孟德尔（Gregor Johann Mendel）以豌豆为材料对遗传学的研究。1866年孟德尔曾发表文章说他的试验是“解决问题的唯一方法”。此后对模式生物的选择遵循两个方面的原则：一是该物种在系统进化中的地位符合研究目的，二是该物种特性适于特定研究的试验需要［2］。在漫长的科学研究历史中，各领域发展了多种模式生物，如大肠杆菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、拟南芥及小鼠等。模式生物的应用大大促进了基础生命科学和实验技术的发展。为阐明模式生物的遗传背景，促进基因组研究，人类基因组计划（HGP）最先提出模式生物基因组计划，并初步确定了6种模式生物：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、拟南芥和小鼠。
1.2 模式生物的各自特点及应用领域
自从莱德伯格（Joshua Lederberg）应用大肠杆 菌（Escherichia coli，E. coli）进行遗传学研究以来［3］，大肠杆菌迅速成为广泛应用的原核模式生物。它具有遗传背景清楚、操作技术简便、成本低、易于大规模培养等特点和优点，而且还特别适合作为外源基因表达的宿主。因此，大肠杆菌是目前应用最广泛、最成功的克隆原核基因的表达体系。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为最简单的低等单细胞真核生物之一，是研究细胞周期、胚胎形态发生、染色体稳定性和衰老的优秀模型，哈特维尔（Leel-and H. Hartwell）和纳斯（P. M. Nurse）以酿酒酵母为材料，为揭示细胞周期的调控机理作出了重要贡献。前者提出了细胞周期关卡（cell-cycle checkpoint）的概念，并确定了大量的控制细胞周期的基因（cdc），后者从粟酒酵母（S. pombe）中分离到第一个基因cdc2，并提出来相关的调控体系［4］。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）结构非常简单，一条雌雄同体的秀丽隐杆线虫只有不超过1 000个细胞，遵循特定的分裂模式。同时，它还具有多细胞生物的基本特征，如复杂的器官系统（complex organ system）、社会行为、性行为和学习行为等，为传染性疾病［5］和多种人类疾病［6］的研究提供模型。许多生物进化的保守机制都是通过秀丽隐杆线虫阐明的，包括程序性细胞死亡（programmed cell death）［7］、胰岛素信号［8］、衰老［9］和神经生物
学（neurobiology）［10］，也使自然免疫和RNA干扰（RNAi）机制的研究取得了巨大进展［11］。20世纪70-80年代，基于对果蝇（Drosophila melanogaster）的研究工作，兴起了胚胎学和分子生物学，从此果蝇成为遗传学研究最重要的材料之一。试验中分离鉴定到大量的果蝇突变体，促进了动物发育学和疾病的研究。拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物界最重要的模式生物，在研究器官发育、植物干细胞生物学［12］、图式形成（pattern formation）［13］、先天免疫（innate immunity）［14］、昼夜节律（circadian rhythm）［15］、各种性征的自然突变［16］以及诸多发育机制中都取得了重要的进展。由于与人类的近亲关系，小鼠（Musmusculus）是人类基因组研究最主要的模式生物之一，也是哺乳动物研究领域最重要的模式生物，广泛用于发育学、分子生物学、分子遗传学、免疫学和生物医学等研究领域［17］。小鼠为人类疾病的研究，包括癌症、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、骨质疏松和青光眼等作出巨大贡献。同时，基因组的靶标操作［18］、正向遗传突变筛选［19］和体外成像技术［20］的高速发展也使小鼠成为干细胞研究的主要模式生物之一。
2 斑马鱼作为模式生物的优越性
作为模式生物，斑马鱼（Danio rerio）不仅有脊椎生物的一般特点，而且具备诸多技术优势：饲养简单、成本较低、繁殖力强、胚胎透明、个体较小、时代时间短、遗传信息丰富、拥有大量实验室突变 系、可进行正向和反向遗传分析等［21，22］。
斑马鱼个体较小，可以在较小的空间里繁殖高密度的种群，利于节省试验成本。时代时间较短，仅3-4个月，有助于长期的遗传学研究。实验室条件下，斑马鱼可常年产卵，允许连续大规模繁殖后代。通常，雌性每周可产卵一次，每次产卵50-200枚。胚胎发育快，受精后24 h（hpf）身体成型，大部分器官96 hpf内发育完全。斑马鱼胚胎个体小，可在微孔反应板上培养；与哺乳动物胚胎在子宫内发育的情况不同，斑马鱼是体外发育（图 1），便于人工操作，如通过控制培养液直接对胚胎进行水处理（water treatment）；胚胎透明度高，且发育快速，易于观察，适于进行显微注射。斑马鱼全基因组测
