促红细胞生成素

获得EPO基因（1）
• 构建基因组噬菌体文库克隆EPO基因 血细胞中提取基因组DNA→BamHⅠ酶切→回 收酶切片段→插入噬菌体EMBL3载体中→构建 基因组噬菌体文库→PCR方法从基因组模板中 扩增EPO基因片段为探针→筛选完整EPO基因 的插入片段→克隆
EMBL3 载体
获得EPO基因（2）
• 人工化学合成的方法获得EPO基因：对部 份氨基酸序列进行修改 • 利用PCR技术扩增EPO基因：人胎肝中提 取总mRNA →RT-PCR技术克隆hEPO基因
基本概念
制作 应用 市场前景
• 细胞因子的一种，在骨髓造血微环境下促 进红细胞的生成。分类上是集落刺激因子。 • 【别名】促血红细胞生长素 ,红细胞生成素， 重组人红细胞生成素 。 • EPO兴奋剂正是根据促红细胞生成素的原 理人工合成，它能促进肌肉中氧气生成， 从而使肌肉来自百度文库有劲、工作时间更长.
• 2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美 元。创下生物工程药品单个品种之最，是 当今最成功的基因工程药物。 • 目前，国内已有10多家单位获准生产红细 胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中 国）生物药业的产品在国内医院的销售额 独领风骚。
市场前景
• 1985年科学家应用基因重组技术，在实验 室获得重组人EPO（rhEPO），1989年安 进（Amgen）公司的第一个基因重组药物 Epogen获得FDA的批准。2003年销售值达 到24.4亿美元，成为名副其实的“重磅炸弹” 基因药物。 • 安进开发的用于治疗恶性贫血症的第二代 促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到 FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。
重组人促红细胞生成素的表达 系统
• 为了获得分子结构和生物学活性与天然 EPO相 似的rhEPO，选用哺乳动物细胞表达系统，如中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统、非洲绿猴肾细 胞COS7表达系统、幼仓鼠肾（BHK）细胞表达 系统。目前国内外首选CHO 细胞表达系统用来 表达生产rhEPO。 • CHO细胞表达系统 ：CHO细胞表达系统能准 确进行转录后重组蛋白的加工修饰，表达的糖基 化蛋白在分子结构和生物学活性方面与天然蛋白 十分接近。 • 昆虫细胞表达系统、乳腺表达系统
用途
• 医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、 组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方 面。 • 体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负 荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。
临床意义
• 1．肾性贫血患者EPO水平较低，在进 行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高 体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增 加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。 • 2．其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性 贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用 EPO治疗，此时浓度也会有所升高。 • 3．再生障碍性贫血和骨髓造血功能不 全患者EPO水平升高。
EPO——基本概念
基因重组人促红细胞生成素 （erythropoietin,EPO）
• EPO是最早发现并首先运用于临床的造血生长因 子， 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素 (rhEPO)。rhEPO成为当前研究开发最成功的基 因工程药物。 • EPO是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合 成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于红系祖细胞 的造血生长因子。 • 在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移， 出生后主要由肾小管间质细胞分泌 。
促细胞生成素的生物学作用
EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细 胞的存活、增殖和分化以调控红细 胞的生成。
• 促进系祖细胞的增殖、分化和成熟
• 调控神经元部分功能
• 对细胞内钙浓度也有明显的调节作 用
促红细胞生成素临床应用
• • • • 肾功能衰竭所致的贫血 癌性贫血 结缔组织病贫血 骨髓增生异常综合征贫血
EPO的分子结构和功能
• 天然存在的 EPO 分为两种类型 , α型含 35 %的糖 基 ,β型含 26 %的糖基。两种类型在生物学特性、 抗原性及临床应用效果上均相同。 • 人类 EPO 含有 166 个氨基酸 ,相对分子质量为34 400 , hEPO上有4个半胱氨酸(7,29,33,161),在7— 161，29—33之间以二硫键相连, 这对维持hEPO 的生物学活性有重要作用。糖基化对稳定 EPO 的 体内活性具有重要作用 ,若缺乏糖链 ,则 EPO 在 体内迅速被水解而失活。
人促红细胞生成素基因重组
• 天然的 hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取 的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此， 在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝 中克隆出 人促红细胞生成素(hEPO)基因, 并 研制成功 rhEPO。 • 研制rhEPO的主要环节包括: 获得人促红细胞生成 素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达 系统等。