小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变试验预实验方法

二氢杨梅素对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用马秀玲;李逸飞;孙圣;李海山
【期刊名称】《发酵科技通讯》
【年(卷),期】2022(51)3
【摘要】用小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变实验来评价二氢杨梅素的致突变性。

在代谢活化和非代谢活化条件下,8种不同质量浓度的二氢杨梅素,作用在一定数量的含有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞中,作用3 h后,离心将上清液弃去加入完全DMEM培养液,连续培养48 h后,分别铺PE 2平板效率和MF突变频率的平板于96孔板中,显微镜下观察MF中的突变细胞集落,计数各剂量组突变细胞的集落数,比较大小集落数与阴性对照组,进行数据统计分析。

在代谢活化和非代谢活化条件下的二氢杨梅素均未引起该细胞突变率的改变。

因此,当二氢杨梅素的终质量浓度为39.06~5000μg/mL时,未能引起小鼠淋巴瘤细胞TK基因位点的致突变性作用。

【总页数】6页(P139-144)
【作者】马秀玲;李逸飞;孙圣;李海山
【作者单位】中检科健(天津)检验检测有限责任公司
【正文语种】中文
【中图分类】R994.4
【相关文献】
1.小鼠淋巴瘤L5178Y细胞tk基因自发分子突变研究
2.秋水仙碱和长春新碱诱导L5178Y小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失分析
3.曼陀罗子对小鼠L5178Y细胞TK基因的致突变作用
4.伏立康唑对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
5.大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
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小鼠淋巴细胞hprt基因突变检测的研究进展杨录军;曹佳【摘要】肿瘤的发生、发展与突变事件密切相关.人类在环境中接触的突变剂的检出依赖于致突变试验.以次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, hprt)基因为报告基因的 hprt突变试验是几个重要的致突变试验之一,其优点在于不仅能检测出突变剂的致突变能力大小,还可以对突变体进行突变谱分析,并且能为多种与 hprt基因突变相关的人类疾病提供研究资料.以小鼠啮齿动物为试验模型的淋巴细胞 hprt基因突变试验近年来得到广泛应用,本文对其研究进展作一综述.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2006(018)005【总页数】3页(P414-416)【关键词】hprt;突变;突变谱;淋巴细胞【作者】杨录军;曹佳【作者单位】第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】Q754次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosy1transferase,hprt)基因突变试验是几个重要的致突变试验之一。

hprt基因编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,催化次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸反应,生成相应的核苷-5-单磷酸(NMP)。

这是一条生成NMP的补充途径。

如果存在6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、8-氮鸟嘌呤(8-AG)等碱基类似物,则以这些物质为底物可生成相应的NMP,参与DNA合成而导致细胞死亡。

如果突变剂使hprt基因失活(hprt-）将导致细胞中的HPRT酶活性大幅度下降从而使(hprt-）细胞能在一定的嘌呤类似物浓度下正常生长而这个浓度足以导致HPRT 酶水平正常的细胞(hprt+)发生死亡。

Ames试验与MLA试验检测两味含马兜铃酸中药的致突变性陆华;马康目;孙皎;陈灵【摘要】背景与目的:检测单味马兜铃及复方龙胆泻肝丸的遗传毒性.材料与方法:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames test)检测含马兜铃酸的两味单、复方中药的细菌回复突变率;采用96孔微孔板接种法进行小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验(mouse lymphoma assay,MLA),经单、复方含马兜铃酸浓度5 μg/ml对L5178Y/tk(+/-)-3.7.2c细胞进行染毒,分别测定其接种效率(PE),相对总增长率(RTG)和突变频率(MF).结果:Ames试验结果为阴性,而小鼠淋巴瘤试验显示单味马兜铃具有一定细胞毒性并诱导tk基因突变,产生突变集落;而复方龙胆泻肝丸未诱发tk基因突变.结论:受试的单味马兜铃具有一定的遗传毒而复方龙胆泻肝丸具有对马兜铃的减毒效应.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)006【总页数】3页(P484-486)【关键词】马兜铃酸;Ames试验;小鼠淋巴瘤细胞试验;tk基因突变;遗传毒理【作者】陆华;马康目;孙皎;陈灵【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海生物材料研究测试中心,200023;上海交通大学生命技术学院,上海;上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海生物材料研究测试中心,200023;上海交通大学生命技术学院,上海【正文语种】中文【中图分类】R282.71;Q754随着中国传统中药进入国际市场，中药的全球化面临着机遇和考验。

马兜铃酸中药引起的中草药肾病(CHN)目前已受到广泛关注，其体内的药理毒性已经有了广泛的研究[1-2]，但如何在临床应用前进行快速、有效的生物学评价就显得尤为重要。

本实验旨在通过传统的Ames试验和小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验(mouse lymphoma assay，MLA)，对单味马兜铃和复方龙胆泻肝丸(含马兜铃)的遗传毒性进行测试和评价。

476 体外哺乳动物细胞基因突变试验(In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test)1 受试物必备化学鉴定纯度(杂质)溶解度熔点、沸点pH(必要时)2 试验目的2.1 目的与意义体外哺乳动物细胞基因突变试验可用于检测由化学物质诱导的基因突变。

适用的细胞系包括L5178Y小鼠淋巴瘤细胞、中国地鼠CHO、AS52和V79细胞系、TK6淋巴样母细胞。

在这些细胞系，最常用的遗传学终点是检测胸苷激酶(TK)突变、次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)突变、黄嘌呤转磷酸核糖基酶(XPRT)基因突变。

TK、HPRT和XPRT突变试验检测不同的遗传事件谱。

TK和XPRT位于常染色体，可检测HPRT(位于X染色体)不能检测的遗传学事件(如大缺失)。

2.2 定义正向突变(forward mutation):从原型基因突变为突变体，引起酶活性或编码蛋白功能丧失。

碱基置换型致突变物(base pair substitution mutagens):引起DNA分子中一个或几个碱基对置换的化学物。

移码型致突变物(frameshift mutagens):引起DNA分子中增加或丢失一个或多个碱基对置换的化学物。

表型表达时间(phenotypic expression time):在新突变的细胞耗尽未改变的基因产物所需的时间。

突变体频率(mutant frequency):观察到的突变细胞数除以存活细胞数。

相对总生长(relative total growth):经过整个时期与阴性对照细胞群比较的细胞数增加，计算为相对于阴性对照的悬浮生长与相对于阴性对照的集落形成效率的乘积。

相对悬浮生长(relative suspension growth):经过表达期相对于阴性对照的细胞数增加。

表达存活率(viability):在表达期后接种选择培养基时的处理细胞的集落形成效率。

处理存活率(survival):在处理期末，处理细胞的集落形成效率。

黄芪在《神农本草经》中被列为上品,为补药之长,具有“益气补虚,扶正固本”之功效,其主要成分为黄芪多糖和黄芪皂苷[5]。

注射用黄芪多糖是通过专利技术获得纯化的阿拉伯半乳聚糖组合物,质量分数达到9815%,临床前研究资料表明该药可以增加动物脾质量,增加小鼠巨噬细胞的吞噬功能;促进人外周血淋巴细胞的增殖功能;增强N K细胞和LA K细胞活性,显著增强某些细胞因子的分泌;促进骨髓造血干细胞的增殖和向红细胞系和粒细胞系的分化,并对放化疗后所致骨髓造血功能的破坏有明显的保护作用[6]。

本临床研究结果表明,注射用黄芪多糖可增强机体免疫功能,提高患者生活质量[7],延长患者的生存时间,且无毒性作用,体现了中药治疗肿瘤对机体的多层次、多环节、多靶点的整体调节,值得临床应用及推广,并且今后应进一步发展临床研究,深入探讨中药治疗原发性肝癌的作用机制。

参考文献:[1]　叶任高,陆再英1内科学[M]1北京:人民卫生出版社,20041[2]　谭庚发,韩永兴1中医中药治疗原发性肝癌研究进展[J]1中国现代实用医学杂志,2006,5(1):432451[3]　周际昌1实用肿瘤内科学[M]1北京:人民卫生出版社,19991[4]　中药新药临床研究指导原则(试行)[S]119991[5]　张蕴超,贾英杰,陈　军1注射用黄芪多糖治疗癌症相关疲劳临床观察研究[J]1中草药,2008,39(3):41724181[6]　赵美蓉,周　洁1黄芪多糖对恶性肿瘤化疗后骨髓抑制的影响[J]1天津中医药,2007,24(2):11421151[7]　何伟星,朱艳仪,李　捷1注射用黄芪多糖对食管癌放疗患者生活质量的影响[J]1江西中医药,2007,38(2):372381大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用笪红远1,2,曾　文3,江振洲1,程安春3,张陆勇1,刘国卿1Ξ(11中国药科大学药学院,江苏南京　210009;21国家药品审评中心,北京　100038;31四川农业大学实验动物工程技术中心,四川雅安　625014)摘　要:目的　评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞T K基因的致突变作用。

TK基因突变试验—L5178Y细胞与TK6细胞的比较研究帅培强;王怡净;等【期刊名称】《癌变．畸变．突变》【年(卷),期】2001(013)004【摘要】TK基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外短期致突变实验，它具有很高的灵敏度，可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。

TK基因突变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等，其基因型均为tk+/-。

使用L5178Y细胞的试验（即小鼠淋巴瘤细胞试验）发展较早，已形成一套比较完善的方法。

而TK6和WTK1等人类来源的细胞在TK基因突变分析中的应用时间还不长，其方法尚不太成熟且资料有限，但因为来源于人类，在评价受试物对人体的损伤方面意义可能更大。

有关小鼠淋巴瘤细胞和人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的灵敏度和特异性方面的比较性研究的报告尚不多见。

本研究使用3种常规诱变剂（MMS、EMS、MMC）和一种非诱变剂（KCl），分别采用琼脂平皿血和微孔平板法对两种细胞（L5178Y与TK6）的灵敏度和特异性进行比较研究。

研究结果表明，直接比较同一受试物诱发两种细胞的突变频率，TK6细胞显著低于L5178Y细胞。

比较两种细胞的相对突变指数时，TK6细胞突变指数显著高于L5178Y细胞。

而且TK6细胞在较低浓度的受试物剂量下即可诱发突变频率、突变指数的显著增加。

说明TK6细胞在本试验中比L5178Y细胞敏感。

两种细胞采用两种方法对4种受试物的致突变性评价结果一致，即3种强致突变剂的检测结果均为阳性；微孔法检测KCl的结果两种细胞均为阳性，而琼脂法的检测结果均为无反应。

结论：使用TK6细胞和L5178Y细胞对4种受试物的检测结果基本一致，但TK6细胞在检测低毒性、低浓度受试物时优于L5178Y细胞。

另外，从对人类的实际意义来看，也应推广TK6细胞在TK细胞突变分析中的应用。

小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK基因突变试验1.目的：在正式试验开始之前需要确定供试品的溶解性并确定适宜的供试品剂量范围。

2.剂量：剂量设计试验通常不考虑供试品的溶解性，分别在有和无S9的情况下接受3小时处理，最高浓度可达5mg/ml（即使其溶解度大于5mg/ml，也就是说这是最大的剂量）；以2倍稀释度向下设6－10个剂量。

3.溶剂：溶剂的选择按其优先顺序依次是RPMI-0、生理盐水、蒸馏水和DMSO，要尽量避免悬浮液，如果供试品不可溶，应用RPMI-0将其制成悬浮液。

4.方法：4.1 收集细胞。

细胞总量应达到6×107个，用RPMI-10培养基悬浮备用。

（收集过程中每天应调整细胞的细胞量为2×105/ml，）。

4.2 将10ml RPMI-10培养基（约含107个细胞）分别置于一系列50ml一次性消毒离心管中。

为使处理用培养基中血清含量降至5％（V/V），RPMI-0、溶剂、供试品、1mlS9混合物（代谢活化系统时）或150mMKCL（非代谢活化系统时）加入离心管的总体积应达到20ml（如表所示）。

表处理时培养基的组成成分成分体积无活化系统有活化系统细胞悬液（106/ml RPMI-10）10ml(107个细胞) 10ml(107个细胞)RPMI-0 8.8ml 8.8mlS9混合物－1ml150 mM KCL 1ml --供试品0.2ml 0.2ml将离心管塞紧并置于振荡器上，37℃水浴3小时。

然后低速离心（1000r.p.m）5分钟，弃去上清液，用PBS(PH7.4)洗涤细胞两次。

重新悬浮细胞于50mlRPMI-10之中，并调整细胞密度为2×105/ml，,转移至培养瓶中。

培养2 天。

每天计数细胞生长（DCG），并调细胞密度为2×105/ml左右。

5. 结果按第1d、第2d的DCG计算相对悬浮生长（RSG）.选择10％－20％RSG作为诱变试验的最高剂量，并以2倍稀释度向下设2－5个剂量。

体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test【试验原理】体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。

这些细胞系，最常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。

TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。

细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。

在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT 的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。

在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。

【参考标准】GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验【材料和试剂】细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。

细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。

培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。

对于 V79和 CHO 细胞，常用最低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。

药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。

拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。

以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA 损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。

染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。

在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。

由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。

但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。

此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。

因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。

二、基本原则（一）实验管理药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。

（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。

丙烯酰胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究袁健;刘胜学;曹佳;熊燕【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2005(017)004【摘要】背景与目的:研究丙烯酰胺(Acrylamide,AA)对小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变频率的影响.材料与方法:使用丙烯酰胺对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别进行细胞毒性,细胞接种效率,相对悬浮生长率和突变频率的测定.结果:随着AA剂量的增加,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均明显降低.在150～750 μg/ml范围内诱导L5178Y细胞tk基因的突变频率高于自发突变频率1～9倍,表明具有较强的致突变性.结论:AA对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,并可以诱导tk基因的突变.【总页数】4页(P202-205)【作者】袁健;刘胜学;曹佳;熊燕【作者单位】第三军医大学军事预防医学院卫生毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院卫生毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院卫生毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院卫生毒理学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】Q754;R733.4【相关文献】1.马兜铃酸诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究 [J], 徐斌;常艳;陈灵2.硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究 [J], 贾庆军;刘胜学;刘晋祎;杨录军;周燕虹;曹佳3.昆明山海棠总生物碱诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究 [J], 刘胜学;曹佳;袁建;黄萍;帅培强;本间正充4.小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测染料木素的诱变性 [J], 邬鸣;张立实5.纺锤体毒剂诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究 [J], 袁健;刘胜学;曹佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第四节化学致突变物的检测一、致突变试验(一) 基因突变试验1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。

试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。

计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。

标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。

这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。

试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。

在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。

将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。

判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。

如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。

只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。

2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。

体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。

TK基因突变属于常染色体基因突变。

TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。

在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。

但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。

若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。

根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。

在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。

染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。

论著 文章编号:100025404(2004)1621426203硫芥诱导L5178Y细胞tk基因突变的研究李奇慧1,朱明学2,张黎明2,董兆君1 (1第三军医大学预防医学院军事毒理学教研室,重庆400038;2第二军医大学海医系防化教研室,上海200433) 提　要:目的　检测硫芥对小鼠淋巴瘤L5178Y3.7.2c2tk+Π-细胞的诱变性。

方法　采用96孔微孔板接种法检测平板接种效率和突变频率。

结果　硫芥可诱导L5178Y3.7.2c2tk+Π-细胞tk位点的突变,诱发突变是自发突变的2～15倍。

在tk位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落,以小克隆为主。

结论　硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒性,产生了大范围的DNA损伤。

关键词:tk;基因;突变;硫芥 中图法分类号:R394;R732354;R827.174 文献标识码:Atk gene mutation of L5178Y cells induced by sulfur mustardLI Qi2hui1,ZH U Ming2xue2,ZH ANGLi2ming2,DONG Zhao2jun1(1Department of Military T oxicology,C ollege of Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing400038;2Department of Navy Medicine,Second Military Medical University,Shanghai200433,China) Abstract:Objective　T o detect the mutagenicity of sulfur mustard in the tk gene of L5178Y3.7.2c2tk+Π-m ouse lym phoma cells.Methods　The plating efficiency and the mutant frequency were detected by the microtiter procedure.Re sults　Sulfur mustard induced tk locus mutation with mutation frequency2-15times higher than that of spontaneous mutation frequency of L5178Y3.7.2c2tk+Π-cells.There were tw o different phenotypes of mutation colonies induced,which were large and small colonies,but m ost of them were small colonies.Conclusion　Sulfur mustard is characterized by marked mutagenic activity and cytotoxicity.The com pound may result in large range of DNA damage. K ey w ords:tk;gene;mutation;sulfur mustard tk基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外短期致突变实验。

十、体外哺乳动物细胞基因突变试验In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1 范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。

2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997)3 试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。

4 定义正向突变（Forward mutation）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。

突变频率（Mutant frequency）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。

5试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。

基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。

6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 受试物6.1.1.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。

受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实储存不影响其稳定性。

6.1.1.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。

首选溶剂是水或水溶性溶剂。

二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。

6.1.1.3 受试物浓度设置6.1.1.3.1 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。

6.1.1.3.2 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（total growth）。