酸性磷酸酶的

）活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
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试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
三、器材：普通离心机，721分光光 度计，恒温水浴箱，研钵等。
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实验内容
一、 ACP的分离纯化 二、 ACP的比活性分析 三、 ACP的动力学分析
沉淀（酶粗提物）
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沉淀（酶粗提物）
约1/3上清液 III蒸馏水， 溶解，洗涤
4000rpm，10min离心
（溶解ACP，
沉淀杂蛋白） 上清液 IV
EDTA9ml，饱和硫酸铵 10ml /100ml上清液 IV，
4000rpm，10min离心
2倍体积预冷甲醇
（ 沉淀ACP）
缓慢搅拌
沉 淀（酶纯化物）
1/V
有抑制剂
分析抑制类型
无抑制剂
1/[S]
KH2PO4对ACP 的抑制作用
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实验安排
1. 实验分组 2. 实验时间安排 3. 实验内容选择与分工 4. 实验报告书写
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谢谢指导
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3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml
蛋白质含量mg/ml
各上清液中ACP的比活性 纯化倍数=
上清液I 中ACP的比活性
各上清液中ACP的活性 总体积 酶的回收率= 上清液I中ACP的活性总体积
竞争性抑制
可逆性抑制 非竞争性抑制
反竞争性抑制
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•竞争性抑制的动力学变化
E + I Ki EI
Vmax[S] 米-曼氏方程变化为： V=
Km（1+[I]/Ki） + [S]
此时， Km增大， Vmax不变
1/V
有抑制剂
无抑制剂
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1/[S]
KH2PO4对ACP 的抑制分析
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3.ACP分离纯化的步骤流程
小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水
研碎，4层纱布过滤
滤液
3500rpm，10min离心
上清液 I
缓慢搅拌
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
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1
Km 1 1
=
+
V
Vmax [S] Vmax
Km
斜率=
1
Vmax
V
纵截距= 1
Vmax
横截距=
-
1
Km
1
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[S]
5.抑制剂-速度（[I]-A）曲线
1.抑制剂的概念： 抑制剂（inhibitor）：能使酶的催化活性下降而
不引起酶蛋白变性的物质
2.抑制作用的分类：
不可逆性抑制
抑制作用
还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。
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三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-A ）曲线
酚生 A 成量
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时间（t）
ACP的 t-A 曲线
2. 酶浓度-速度（[E]-A）曲线
反应 速度
V
酶蛋白含量（E）
ACP 的 [E]-V 曲线
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临床应用广
2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度 不同，以次逐步离心分离；
ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液， 在70ºC仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性 沉淀和分段盐析。
3. pH-酶活性 （pH-V）曲线
反应 速度 V
最适pH
pH
ACP的pH-酶活性曲线
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4.底物浓度-速度（[S]-V）曲线
1.影响方式：
•当[S]较低时，V随[S]的
增加呈正比例增加
Vmax
•当[S]较高时，V随[S]的
增加减慢
V
•当[S]增大到某一值时，V
达到最大反应速度Vmax
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概述
• 酶在物质代谢及调节中的重要意义； • 常用的酶蛋白分离纯化方法； • 酶ห้องสมุดไป่ตู้检测在临床生化检验中的意义； • 酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。
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目的要求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP
蒸馏水溶解，洗涤 4000rpm，10min离心
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上清液 V （酶液）
二、 ACP的比活性分析 1.各上清液中蛋白质含量测定
原理：染料结合比色法——CBBG-250， max=595nm；
步骤：标准曲线制作
各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。
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2.影响曲线：
（矩形双曲线）
Km
[S]
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曲线方程——米-曼氏方程
Vmax[S] （1）米-曼氏方程： V=
Km + [S] V： 某一时刻的反应速度 [S]：某一时刻的底物浓度 Vmax： 反应系统能够达到的最大反应速度 Km：米氏常数
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Km和Vmax的测定：
•双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得
2.各上清液中ACP活性测定
酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由 ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max = 510 nm；
注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供ACP反应条件 碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件
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上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉 上清液 III
淀杂蛋白）
缓慢搅拌
70ºC水浴2min 冷水浴3min
4000rpm，8min离心
上清液
缓慢搅拌 饱和硫酸铵 51ml /100ml上清液 II
5000rpm，10min离心
（ 沉淀ACP）
1. 时间进程（t-V ）曲线 2. 酶浓度-速度（[E]-V）曲线 3. pH-酶活性 （pH-V）曲线 4.底物浓度-速度（[S]-V）曲线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
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一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛
分子量100kD
最适pH5.0
热稳定性较好
溶解度较高