[精华]鲎试剂试验方法

一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。

2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。

3. 提高微生物学实验技能。

二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。

鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。

根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。

- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。

2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。

- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。

3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。

- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。

4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。

2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。

3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。

六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。

2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。

3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。

七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。

在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。

同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。

USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。

本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。

本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。

*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。

检测时，可用其中任一种方法进行试验。

当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。

直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。

内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。

[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。

]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。

两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。

主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。

使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。

动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。

仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。

*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。

若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。

[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。

]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。

鲎试剂灵敏度复核试验
一.试验目的
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

二.试验步骤
1.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。

2.取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

3.将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。

三.结果分析
1.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。

2.若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。

计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。

3.反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性
结果的浓度。

4.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

四.注意事项
1.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。

细菌内毒素试验（鲎试验）要点及控制方法一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。

产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。

如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。

另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。

细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A 成分。

和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。

它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。

热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。

细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。

但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。

热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。

来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。

常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。

使用的活性炭应符合药典规定要求。

(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。

因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。

(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。

因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。

(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。

(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。

鲎试验法检验某些抗生素原料药及其注射液等细菌...孟庆玲;杨锐【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】1992(17)6【摘要】鲎试验法(以下简称鲎法)是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应形成凝胶,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

本法具有快速、灵敏、简易、经济、实用性强等优点,因此受到世界各国科学家们的普遍重视。

目前已被世界科学较发达国家如美,英、欧洲药典所收载。

我国于1988年10月由中华人民共和国卫生部中国药典委员会颁布了《细菌内毒素检查法和鲎试剂标准(试行)》,并仅做为注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素的检查方法。

我们参考国内外资料,从1981年开始将此法应用在大输液内毒素的检验,证明该法有实用价值,并把实践中应用的体会写成了《鲎试验检测输液热原的体会》一文载于《辽宁药检通讯》杂志(1987年第一期44页)。

我们所阐述的理论及供试品的稀释公式被后来国内外文献报道所证实,是基本一致的。

然而,有大量的需要做热原检查的品种,还仍用传统的兔法(费时、费力、不经济),这些品种是否可应用快速、灵敏、经济的鲎法来检查,是科学工作者急待解决的问题。

鉴于上述情况,我们从1989年末开始把鲎法应用到抗生素,Vc等注射液的原料药,【总页数】3页(P467-469)【作者】孟庆玲;杨锐【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】TQ460.72【相关文献】1.鲎试剂检测复方柳安咖注射液中细菌内毒素的可行性研究 [J], 赵祎;张红宇;王莉;李海山2.特异性鲎试剂和非特异性鲎试剂对艾迪注射液中细菌内毒素检测的比较 [J], 施震;尹银嘉;李华3.鲎试剂法检测抗生素类药品的细菌内毒素 [J], 李敏红;汪穗福;刘效昌4.直接药敏试验法和常规药敏试验法在血液细菌检验中的应用研究 [J], 庄浩林5.鲎试剂检测10种注射用抗生素中细菌内毒素的可行性试验 [J], 刘红卫;李向荣;杜文力;王明霞;侯娟;王欣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。

在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。

【试剂盒组成】细菌内毒素工作品，2支鲎试剂， 1.7ml/支，2支显色基质，1.7ml/支，2支偶氮化试剂1，10ml/支，2支偶氮化试剂2，10ml/支，2支偶氮化试剂3，10ml/支，2支HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。

【用法】1 .材料和设备1.1 试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。

1.2器材旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。

恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。

一、实验目的1. 了解鲎试验法的基本原理和操作步骤。

2. 学会使用鲎试验法检测细菌内毒素。

3. 掌握细菌内毒素对生物体的危害及预防措施。

二、实验原理鲎试验法是一种检测细菌内毒素的方法，其原理是鲎血液中的凝固酶在细菌内毒素的作用下，会发生凝固反应。

通过观察鲎血液凝固的情况，可以判断样品中是否含有细菌内毒素。

三、实验材料1. 鲎血液试剂2. 细菌内毒素标准品3. 待测样品4. 实验器材：移液器、试管、恒温水浴锅、计时器等四、实验步骤1. 准备工作（1）将鲎血液试剂置于37℃恒温水浴锅中预热10分钟。

（2）取试管若干，标记为A、B、C、D，分别加入鲎血液试剂。

2. 标准曲线绘制（1）取标准品，按照说明书要求，用生理盐水进行稀释，得到一系列浓度梯度的标准品溶液。

（2）取试管A，加入鲎血液试剂1ml，再加入标准品溶液0.1ml，混匀。

（3）按照相同方法，分别向试管B、C、D中加入不同浓度的标准品溶液，混匀。

（4）将试管置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。

（5）观察各试管凝固情况，记录凝固时间。

3. 待测样品检测（1）取试管E，加入鲎血液试剂1ml，再加入待测样品0.1ml，混匀。

（2）将试管E置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。

（3）观察试管E凝固情况，记录凝固时间。

4. 结果分析（1）以标准品浓度为横坐标，凝固时间为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得对应的细菌内毒素浓度。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：通过绘制标准曲线，可以得到标准品浓度与凝固时间之间的关系，为待测样品的检测提供依据。

2. 待测样品检测：根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得细菌内毒素浓度为5EU/ml。

六、实验结论本实验采用鲎试验法成功检测出待测样品中的细菌内毒素，浓度为5EU/ml。

结果表明，鲎试验法是一种简单、快速、灵敏的细菌内毒素检测方法，适用于临床和科研领域。

七、实验讨论1. 鲎试验法具有操作简便、快速、灵敏等优点，是一种理想的细菌内毒素检测方法。

光度法鲎试剂
光度法鲎试剂是一种用于测定蛋白质浓度的试剂，其原理是利用鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。

该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。

光度法鲎试剂的原理是基于鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。

鲎蛋白是一种具有高度稳定性和可重复性的蛋白质，其与试剂中的染料结合后会产生吸收峰的变化，这种变化与蛋白质的浓度成正比。

因此，通过测定吸收峰的变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。

光度法鲎试剂的操作非常简单，只需要将试剂与待测样品混合后，通过分光光度计测定吸收峰的变化即可。

该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。

在实际应用中，光度法鲎试剂可以用于测定多种类型的蛋白质，包括纯化的蛋白质、细胞裂解液中的蛋白质、血清中的蛋白质等。

同时，该试剂还可以用于测定蛋白质的相对分子质量、酶的活性等指标。

总之，光度法鲎试剂是一种非常实用的蛋白质浓度测定试剂，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。

一、实验目的1. 了解鲎实验的基本原理和方法；2. 掌握鲎实验的操作步骤；3. 学会观察和分析实验结果；4. 培养实验操作技能和实验报告撰写能力。

二、实验原理鲎实验是一种检测细菌内毒素的方法。

鲎是一种生活在海洋中的生物，其血液中含有一种特殊的凝固蛋白，当与细菌内毒素接触时，会迅速凝固。

通过观察鲎血液凝固的时间，可以判断细菌内毒素的存在和含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：鲎血液、细菌内毒素标准品、生理盐水、注射器、试管等；2. 实验仪器：恒温箱、显微镜、计时器等。

四、实验步骤1. 准备工作：将鲎血液和细菌内毒素标准品分别放入无菌试管中，加入适量生理盐水稀释；2. 设置实验组：将稀释后的鲎血液和细菌内毒素标准品分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；3. 设置对照组：将稀释后的鲎血液和生理盐水分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；4. 加入细菌内毒素：在实验组和对照组的试管中分别加入适量的细菌内毒素；5. 混匀：用无菌棉签轻轻搅拌试管中的混合液，使细菌内毒素充分溶解；6. 观察和记录：将实验组和对照组的试管放入恒温箱中，观察鲎血液凝固的时间，并记录实验结果；7. 结果分析：根据实验结果，判断细菌内毒素的存在和含量。

五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组中，鲎血液在加入细菌内毒素后迅速凝固，对照组中，鲎血液在加入生理盐水后无明显变化；2. 结果分析：实验结果表明，细菌内毒素能引起鲎血液凝固，从而判断细菌内毒素的存在。

根据实验结果，可以推算出细菌内毒素的含量。

六、实验总结1. 鲎实验是一种检测细菌内毒素的有效方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点；2. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免污染；3. 通过本次实验，掌握了鲎实验的操作步骤，提高了实验操作技能和实验报告撰写能力。

七、注意事项1. 实验过程中，应严格遵守无菌操作原则，避免污染；2. 实验操作时应保持冷静，避免慌乱；3. 实验结果分析时，应结合理论知识，准确判断细菌内毒素的存在和含量；4. 实验报告撰写时，应清晰、简洁、有条理地表达实验过程和结果。

精心整理文件编号：版本：鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书1.0 目的对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。

2.0 职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。

3.0 范围适用于本公司细菌内毒素检查法。

4.0 参考文件2010年版《中国药典》二部附录ⅪE细菌内毒素检查法2010年版《中国药品检验标准操作规范》细菌内毒素检查法《细菌内毒素检查法及其应用》第一版，气象出版社5.06.06.16.2 料6.2.1 细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。

6.2.2 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。

6.2.3 鲎试剂规格一般选用0.25EU/ml。

7.0 操作步骤7.1 提前30min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用75%乙醇擦拭超净工作台。

试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。

7.2 制备细菌内毒素标准溶液7.2.1 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。

7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。

封口膜封口，置漩涡混合器上混匀15min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。

每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。

注：在使用过程中，标准品溶液若静置超10min，必须重新混匀30s再重新使用。

7.2.3 试验举例设细菌内毒素工作标准品为100EU/支；待测鲎试剂λ=0.25EU/ml。

稀释过程如下：取细菌内毒素标准品100EU/支+1ml检查用水100EU/ml取0.2ml100EU/ml溶液+1.8ml检查用水10EU/ml取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml检查用水1EU/ml0.5EU/ml7.4浓度的第毒第毒第注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。

一、实验目的1. 了解鲎的生物学特征及实验操作方法。

2. 掌握鲎血细胞凝集反应的原理及操作步骤。

3. 观察鲎血细胞凝集现象，分析实验结果。

二、实验原理鲎是一种生活在海洋中的节肢动物，其血液中含有一种特殊的酶——凝固酶。

当鲎血液接触到细菌或毒素时，凝固酶会被激活，使血液凝固。

因此，鲎血液凝固反应可以作为一种检测细菌和毒素的方法。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：鲎血液、细菌悬液、毒素悬液、生理盐水、试管、滴管、显微镜等。

2. 实验仪器：离心机、恒温水浴锅、计时器等。

四、实验步骤1. 准备工作（1）将鲎血液和生理盐水分别加入试管中，混匀。

（2）将细菌悬液和毒素悬液分别加入试管中，混匀。

2. 鲎血细胞凝集反应（1）取一试管，加入鲎血液和生理盐水各1ml。

（2）用滴管取适量细菌悬液，滴入试管中，混匀。

（3）将试管放入恒温水浴锅中，计时30分钟。

（4）观察鲎血细胞凝集现象。

3. 结果分析（1）若鲎血细胞发生凝集，说明细菌存在。

（2）若鲎血细胞未发生凝集，说明细菌不存在。

4. 清洗与消毒（1）将实验操作过程中用过的试管、滴管等实验器材进行清洗。

（2）使用消毒液对实验操作区域进行消毒。

五、实验结果在实验过程中，观察到鲎血液与细菌悬液混合后，血液凝固，出现凝集现象。

因此，可以判断实验中的细菌存在。

六、实验讨论1. 鲎血液凝固酶在实验过程中发挥了重要作用，通过观察鲎血细胞凝集现象，可以判断细菌的存在。

2. 实验过程中，要注意操作规范，避免细菌污染和实验误差。

3. 鲎实验作为一种检测细菌和毒素的方法，具有操作简便、结果直观等优点，在微生物学、医学等领域具有广泛的应用。

七、实验总结本次实验通过对鲎血液凝固反应的观察，了解了鲎的生物学特征及实验操作方法，掌握了鲎血细胞凝集反应的原理及操作步骤。

实验结果表明，鲎实验在检测细菌和毒素方面具有实际应用价值。

在今后的学习和工作中，我们将继续深入研究鲎实验，为微生物学、医学等领域的发展贡献力量。

鲎试剂标准本品为鲎科动物东方鲎（Tachyplecus tridentatus）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。

本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme），凝固蛋白原（Coagulagen）其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。

（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。

（二）鉴别1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。

2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。

3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。

（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。

自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。

缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。

（四）灵敏度测定预测：1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。

2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。

取10×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。

显色法鲎试剂下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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鲎试验检测原理鲎试验是一种常用的实验方法，用于检测某种物质对生物体的毒性。

其原理是通过观察和测量鲎的反应来评估物质的毒性程度。

本文将详细介绍鲎试验的检测原理，并探讨其在毒性评估领域的应用。

鲎（Daphnia magna）是一种常见的淡水甲壳动物，被广泛应用于生态毒理学研究中。

鲎试验通常通过将一定浓度的待测物质溶解于适当的培养液中，然后将鲎放入该溶液中进行暴露。

在暴露过程中，观察鲎的反应和行为变化，以评估物质对其的毒性影响。

鲎试验的原理是基于鲎对外界环境的敏感性和响应能力。

作为一种无脊椎动物，鲎的生理机制相对简单，但其对物质的反应却相当敏感。

在暴露于待测物质后，鲎可能会出现一系列的反应，如运动减缓、摇摆、蜷缩、翻滚等。

这些行为的变化可以作为评估物质毒性的指标。

鲎试验通常采用半静态暴露方式，即在一定时间内观察鲎的反应。

实验中，需要控制好待测物质的浓度和暴露时间，以确保实验结果的准确性和可比性。

一般而言，浓度和暴露时间会根据具体实验目的和要求进行调整。

较低浓度和较短暴露时间可用于初步筛选，而较高浓度和较长暴露时间则可用于更详细的毒性评估。

鲎试验的优势在于其简单、快速和经济的特点。

相比于其他生物毒性检测方法，鲎试验不需要复杂的设备和实验条件，且实验时间相对较短。

此外，鲎试验还可以用于不同类型物质的毒性评估，包括化学物质、环境样品和废水等。

然而，鲎试验也存在一些限制和局限性。

首先，鲎试验只能评估物质对鲎的急性毒性，对于慢性毒性和长期影响的评估有一定局限性。

其次，鲎试验的结果需要结合其他生物毒性检测方法和实际环境数据进行综合评估，以更准确地评估物质的毒性。

最后，鲎试验虽然能够提供初步毒性信息，但并不能直接推断物质对人类的毒性。

尽管存在一些限制，鲎试验仍然是一种重要的毒性评估方法。

其简单、快速和经济的特点使其广泛应用于环境监测、新化学物质评估和药物安全性评价等领域。

同时，鲎试验在法律法规中也被广泛采用，作为生物毒性评估的标准方法之一。

鲎试剂使用说明书凝胶法鲎试剂使用说明书一、检测步骤1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下：0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5mlE10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.032.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。

2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。

3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。

4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。

在孵育期间避免任何震动！二、结果判断1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。

取出试管应尽量避免受到震动造成假阴性结果！2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结果无效。

3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。

鳖珠溶解物实验
鲎试验是检测内毒素的一种试验方法，试验灵敏，能检出微量（0.0001μg，ml）内毒素。

鲎是一种冷血动物，其血细胞的溶解产物与内毒素相遇即被凝固，机制尚不清楚，可能是溶解物中含有凝固蛋白原和一种高相对分子质量的凝固酶原，凝固酶原经内毒素激活转化成凝固酶，此酶使蛋白酶原变为凝固蛋白，再通过交联酶的作用，相互聚合形成纤维状凝胶。

1.鲎试验试剂一套，待检测样品；
2.大肠杆菌内毒素（阳性对照）、无菌蒸馏水、待检液等；
3.吸管、小试管、试管架等。

1.将鲎试剂按要求加入等量的不含有热原质的无菌蒸馏水，振摇2～3min使之溶解。

2.在试验管、阳性对照管及空白对照管中各加溶解物0.1ml。

3.试管中加待检液0.1ml，阳性对照管加大肠杆菌内毒素0.1ml，空白对照管加溶解水0.1ml，置37℃水浴1h后观察结果。

1.阳性对照管出现凝固，空白对照管无变化时，试验结果正确，再观察待检测样品管。

2.试验管出现凝固为阳性，证明有内毒素存在，如未出现凝固，证明无内毒素存在。