Western blot 的详细操作步骤
一．蛋白样品的提取
1.先从-80°冰箱内取出sham 1d/3d组，SAH+PBS 1d/3d组，SAH+SP 1d/3d组，
SAH+Tregs 1d/3d组脑组织样品(区分脑皮层，海马区)，并对这四种样品进行编号样品1,2,3,4,等脑组织在室温下复温后，用预冷的PBS将脑组织表面的血性物质冲洗掉，并用吸水纸吸掉组织表面多余的水分，然后分别把样品1,2,3,4放到预冷的培养皿1,2,3,4中，分别用眼科剪刀1,2,3,4将脑组织分别剪成一个大块以及几个小块。然后分别将样品1,2,3,4称重，每个脑组织样品秤取500mg(可变化)并分别装入2ml的预冷的EP管中，同时把匀浆器（编上编号）置于冰盒内预冷。
2.按照每250mg脑组织加入1ml的RIPA的比例加入对应量的RIPA于盛有脑组织的
EP管1,2,3,4中，同时按照裂解液：cocktail=1:500的体积比加入cocktail(我们有现成的试剂)（一种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶降解蛋白），然后用眼科剪刀（注意：不同的样品用不同的剪刀，提前把剪刀编上号1,2,3,4）将脑组织剪碎，尽量剪的碎一点以利于下一步的匀浆。
注意：这一步的处理过程要在冰盒中进行以抑制蛋白质的降解。
3将已经剪碎的EP管1,2,3,4中的脑组织倒入对应序号的匀浆器1,2,3,4中，在冰上匀浆脑组织，直至匀浆液变得无颗粒（大致用30min，最少是1次/分钟，尽量多匀浆几次）。
4.匀浆结束后，用1ml的移液枪将匀浆好的脑组织匀浆液从匀浆器中转移到对应序号的
预冷的EP管1,2,3,4（提前将要用的EP管编上号1,2,3,4并置于冰上预冷）中.每个样品转移2ml样品匀浆液。
5. 先将盛有脑组织匀浆液的EP管配平(移液枪吸取等量)后，将其放入离心机内，4℃
离心，18000 rpm 20min。
6. 用移液枪从分层后的液体中抽取上清液(大约吸取0.5-1ml)，并转移到在冰盒中预冷的另外4个EP管1,2,3,4中，保存上清于-80度冰箱内直至使用。
二，Western blot之蛋白定量（蛋白浓度测定）
采用96孔板法
（1.）试剂如下表配置
注意：样品BSA栏中加入稀释后的样品25ul，根据样品稀释倍数来决定PBS与原液的比例，最后保证加入的样品总体积达到25ul。
（2）将表一配制的溶液加到96孔板中，每个浓度的标准品以及样品都另设1-2个复孔。
（3）将96孔板37°干燥30min.
（4）将96孔板放入酶标仪中，490nm/630nm波长处测定吸光度值(BCA法预实验表明，490-630nm广谱测数据后，计算蛋白浓度基本一致)。
（5）根据得到的标准曲线和样品的OD值计算样品的浓度。
三．WESTERN BLOT 样品处理
1.按照每30μl蛋白样品加入10ul上样缓冲液的比例（就是将4xloading buffer稀
释4倍）来使用。
如果4xloading buffer中不含有DTT就按照4xloading buffer：DTT=4:1的比例加DTT.
2.混匀后，100°水浴加热5-10分钟（8分钟即可），使蛋白变性。
注意：水浴时，将盛有样品的EP管置于“浮子”上，要保证蛋白液面在水浴液面之下，以及EP管的底不要接触到水浴锅的底。一定要保证水开后（开始沸腾后）再把盛有样品的EP
管放进去。
3．水浴结束后，从水浴锅内取出EP管，迅速置于冰上，至温度降下来后再将EP管放到-20°或者是-80°冰箱内备用。如果后续工作准备就绪，也可以将EP管从水浴锅内取出冷却至室温后，14000rpm离心5分钟，取上清直接上样电泳即可（EP管内样品呈紫蓝色，只有底层有少量的沉淀，上清占大部分）。
四．Western blot之聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
1.1. 清洗玻璃板：双手戴乳胶手套，一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗（注
意玻璃板周围的擦洗，容易被忽略）。两面都擦洗过后用自来水冲，再用洗瓶蒸馏水冲洗干净后用电吹风吹干。
2.灌胶与上样
①.玻璃板对齐后放入夹中卡紧（要保证两块玻璃板的下缘平齐，尽量往下压玻璃板使其
与底部的海绵垫充分接触以免漏胶），然后垂直卡在架子上准备灌胶。
②.对于MMP-9，灌注8%的分离胶，对于Active caspase-3，灌注12%的分离胶。
50ml的烧杯1配制8%的分离胶，10ml的配方以及加入的顺序如下：
5.3ml的超纯水---2.5ml的1.5M的Tris(PH=8.8)--- 0.1ml的10%的SDS--- 0.1ml
的10%的过硫酸胺---2.0ml的30%的丙烯酰胺---最后加入0.008ml的TEMED.
50ML的烧杯1配制12%的分离胶，10ml的配方以及加入的顺序如下：
3.3ml的超纯水---2.5ml的1.5M的Tris(PH=8.8)--- 0.1ml的10%的SDS---0.1ml 的10%的过硫酸胺---
4.0ml的30%的丙烯酰胺---最后加入0.004ml的TEMED.
③加入TEMED后立即摇匀（可以用枪吹打均匀）即可灌胶，灌胶时，用1ml枪吸取1ml
胶沿玻璃板的一边加入（灌胶时开始可以快一点，胶面快到所需高度时要放慢速度，而且操作时胶一定要沿着玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡），待到胶面升到绿带中间线高度时即可（分离胶的高度要保证灌完浓缩胶，插梳子后梳齿的下沿不要接触到分离胶的上缘，
要保持一段距离），然后在分离胶上加入异丙醇封胶（加异丙醇封胶时要慢，），1-1.5个小时后（在异丙醇和胶之间会有一条折射线出现，这就说明胶已经凝了）倒掉异丙醇，用自来水先反复洗涤10遍，然后用超纯水洗3次（因为异丙醇为有机溶剂，要洗到油光消失），
最后用条状定性滤纸将残留的超纯水吸干。
④配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
用50ml的烧杯2配制5%的浓缩胶溶液，6ml的浓缩胶的加入的顺序如下：
4.1ml的超纯水---0.75ml的1M的Tris(PH=6.8)---0.06ml的10%的SDS---0.06m10%过硫酸胺---1.0ml 30%丙烯酰胺---0.006ml TEMED
加入TEMED后立即用1ml的移液枪吹打均匀即可灌胶。
⑤.灌胶时用1ml的移液枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！将剩余空间灌满
浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。（插梳子时要使梳子的一边先插到位，再缓缓将梳子的另一边压下去）这样可以避免气泡的产生。
⑥. 在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，待到浓缩胶凝固以后，大概需要1-1.5个小
时，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。（注意：拔梳子的时候双手平衡用力将梳子平行拔出，不要把孔拔歪）。
配方：5×电泳缓冲液
Tris 30.2 g
甘氨酸188g
SDS 10 g
溶解后用浓盐酸调pH至8.3，用超纯水定容至2L,室温保存。
电泳液的配制：用5xTris-甘氨酸电泳缓冲液（索龙宝公司的500ml每瓶）
