蛋白质浓度测定一一考马斯亮蓝染色法（实验报
告）
实验日期：2015年4月28日实验温度：室温
实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师:二
班级:2013级生物技术1班姓名:** 学号:********
I. 实验目的
1. 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；
2. 熟悉蛋白质含虽测定的影响因素。
II. 实验原理
考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm,与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm,在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含虽成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质一考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含虽。
III. 实验试剂与仪器
1. 实验试剂
⑴100 p g/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL
的0.1mol/L氢氧化钠溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL ,蒸［留水定容至500mL。
(3) 正常人血浆。
2. 实验器材
可见分光光度计，100 微虽移液器16支，5mL刻度
吸管8支，中试管。
IV.实验操作步骤
.绘制标准曲线取中试管支，按下表加入各种试剂
混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白,
记录于下表，绘制标准曲线
标准曲线绘制数据表
2. 样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL,各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min ,以“ 0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含虽。
V.实验结果分析
结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为:
①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。
VI.注意事项
1.考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5〜20min内比色，
布的超过1h;
2.蛋白质-染料复合物少虽附于比色杯，不影响测定, 可用乙醇洗净。
