荧光光度法在食品分析中的应用示例PPT课件

实验条件
仪器及附件：
F-380型荧光分光分光度计 荧光石英比色皿
分析条件：
激发波长：350nm 发射波长：430nm
药品：
淀粉酶、偏磷酸-乙酸溶液、酸性活性炭、乙酸钠溶液、 硼酸-乙酸钠、邻苯二胺溶液、维生素C标准溶液等
其他：
分析天平（0.0001g）、称量纸、容量瓶、三角瓶、移液 管、具塞比色管、烧杯、水浴锅、擦镜纸等。
2、实验条件
标定值的设定：使用真菌标定标准物
仪
绿色
红色
黄色
器
Vicam4 系
列
来自百度文库
-1
22
11+2
３、实验步骤
称取磨细的试样（饼干）25.0ｇ于搅拌器中，加入5g氯 化钠及125mL甲醇-水(6+4)，以均质器高速搅拌提取1-2min。 将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于干净的容器中。准 确移取20.0mL滤液并加入20.0mL纯水稀释，混匀，用玻璃纤 维滤纸过滤１次，至滤液澄清,备用。将上步10mL滤液以１ －２滴/秒的流速全部通过免疫亲和柱，直至空气进入到亲 和柱中。将10mL纯水以２滴／秒的流速通过亲和柱。再用10 mL纯水以２滴/秒的流速通过亲和柱直至空气进入到亲和柱 中。用1.0mLHPLC级的甲醇以1-2滴/秒的流速淋洗亲和柱， 将所有的样品淋洗液收集于玻璃测试管中。将1.0mLAflaText 显色剂加到测试管的淋洗液中，混匀，将测试管置于已标定 好的荧光中，60s后读数。
浓度为2.50、5.00、7.50、10.0ug/mL的VC标准样品工作液。
测定结果
应用F-380型荧光分光光度计的“光度测定”模块建立维生素 C的标准工作曲线，并进行样品测定。
结果计算
X V f 100
m
1000
式中：X—样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g;
—由标准曲线查得或由回归方程算得的样品溶液浓度，
标准样品待测溶液制备
精密称取0.050gVC标准样品，用偏磷酸-乙酸溶液A溶解并 定容至50mL，再准确吸取10.0mL该溶液用偏磷酸-乙酸溶液A 稀释并定容至100mL，配置成100ug/mL的标准溶液（临用前配 置）
准确吸取经过处理的VC标准溶液（10ug/mL）0.5mL、1.0mL、1.5mL、 2.0mL分别置于10mL试管中，补水至2.0mL，配置成
X C m V /100
式中：X— 样品中甲醛含量,mg/kg;
C— 从标准曲线上查得的样品分析液中甲醛含量,µg; m— 样品质量,g; V —样品分析液体积,ml; 100— 样品处理的定容体积,ml。
三、荧光光度法测定饼干中的黄曲霉毒素
黄曲霉毒素（Aflatoxin）是众所周知的最危险的毒素 之一，简称AFT，是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组以二 呋喃香豆素为基本结构的化合物。其中黄曲霉毒素，Ｂ１、 Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２是最主要的毒素物质。1993年，黄曲霉毒 素被世界卫生组织（ＷＨＯ）的癌症研究机构划定为Ｉ类致 癌物。
待测样品制备
样品经前处理后还需进一步的处理才可以进行检测。 处理后的乳粉试样+2g酸性活性炭混匀过滤，得滤液→分别
取5.0mL于25mL容量瓶，并编号为1号、2号→1号瓶中+5mL硼 酸-乙酸+样品空白溶液，2号瓶中+5mL乙酸钠+样品溶液→分 别取2.0mL与10mL比色管中→分别加入5mLOPDA溶液，静置闭 光，放置60min →1号为样品空白溶液，2号为样品溶液。
样品前处理
样品前处理
乳粉样品含淀粉样品：分别取固体5g、液体约20g于150mL 三角瓶+淀粉酶+50mL蒸馏水→用氮气排空空气→塞上瓶塞 →于45°下培养30min→取出冷却→用偏磷酸-乙酸溶液定容。 乳粉样品不含淀粉样品：固体5g+偏磷酸-乙酸溶液A溶解、 液体约50g+偏磷酸-乙酸溶液B溶解→混匀→定容至100mL。 此为样品前处理溶液。
一、荧光光度法测定食品中维生素C的含量
原理
维生素C（抗坏血酸）在 活性炭存在下氧化成脱氢抗坏 血酸，它与邻苯二胺（OPDA） 反应生成荧光物质（喹唔啉）， 用荧光分光光度计测定其荧光 强度，其荧光强度与维生素C 的浓度成正比。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形 成复合物不与邻苯二胺反应， 以此排除试样中荧光杂质产生 的干扰。
1.4、测定方法
1.4.1、标准曲线绘制 吸取甲醛标准0、0.25、0.50、1.00、 2.00、3.00、4.00、5.00ml于10ml比色管中,各管用水稀释到 8ml,加2ml乙酰丙酮溶液,摇匀后于沸水浴中加热5min,冷却后 在Ex=430nm,Em=505nm处测定相对荧光强度。以甲醛含量 为横坐标,相对荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。 1.4.2、样品测定取1.00~8.00ml样品处理溶液,按标准系列相 同步骤操作测定其相对荧光强度。根据标准曲线法定量。 1.4.3、食品中甲醛的含量按公式(1)计算：
荧光分光光度法在食品分析中的应用示例
化工0901 黄高能
200906010106
荧光分光光度法的特点
荧光分析法（PCF）具有灵敏度高、 选择性好、线性范围广等特点。近 年来随着分析测试技术的迅速发展， 人们对样品分析的要求也愈来愈高， 而PCF技术由于自身优势，特别是 与HPLC等技术的结合，在各方面 的应用越来越受到人们的关注。下 面对荧光分光光度法在食品中的几 种应用进行一些介绍。
µg/mL;
V —荧光反应所用试样体积；mL ƒ —样品溶液的稀释倍数； m—试样质量，g。
二、荧光光度法测定食品中的甲醛
1、材料和方法
1.1、原理 ：甲醛与乙酰丙酮在一定条件下定量反应生成吡
啶衍生物,该产物的相对荧光强度在一定范 围内与甲醛浓度 成正比。
1.2、仪器与试剂 ：960荧光分光光度计。甲醛标准溶液
(1µg/ml);乙酰丙酮溶液，称约15g乙酸铵溶于水中,加入 0.3ml乙酸和0.4ml乙酰丙酮,用重蒸馏水定容至100ml。此液 于棕色瓶中能保存1个月。
1.3、样品前处理：称取经粉碎的样品1~5g,以少量水湿润后
移入100ml容量瓶中,加入80ml重蒸馏水,浸泡于80水浴中 30min以上,冷却至室温,用水稀释至刻度,过滤备用。如有浑 浊可蒸馏后测定。
实验部分
1、试剂和仪器
1.1、试剂 水为重蒸馏水；甲醇:色谱纯；氯化钠（NaCl）；pH=7
磷酸盐缓冲溶液0.1%；吐温／PBS溶液。
１.2、仪器
高速均质器（美国Vicam公司）；玻璃纤维滤纸直径 11cm，孔径1.5μｍ（美国Vicam公司）免疫亲和柱（美国 Vicam公司）；内含单株抗体对黄曲霉毒素Ｂ1具有专一性。 空气压力泵（美国Vicam公司）； 玻璃试管（12m × 75mm ，无荧光特性）；玻璃注射器，微量注射器；微型移液枪。