一.实验内容
实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：
10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)
实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：
考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸
实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：
dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素
实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：
PBS（PH=7.0） 30% H2O2
实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：
ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O
实验6： ASA(维生素C)含量测定
偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）
实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：
NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)
实验8：脯氨酸测定所需试剂：
磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸
试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮
试验9：GR活性测定
试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸
试验11：超氧阴离子含量测定
二．酶液和母液提取
1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）
2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸
1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：
1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）
↓
4℃冷冻15000g离心20分钟
↓
上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）
2．ASA . GSH母液提取：
0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液
↓
4℃冷冻14000g离心10分钟
↓
上清液即为母液（5℃下保存备用）
（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）
酶液提取所需试剂：
PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS
EDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBS
PBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O
取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用
PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)
需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）
母液提取所需试剂：
5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒
（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）
（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）
三．实验步骤
实验1：MDA含量测定
1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml
0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml
（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）
1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，
加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液
↓摇匀
95℃加热15分钟
↓快速冷却
3000g离心15分钟
↓
取上清测定 OD532，OD600，OD450值
↓
按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)
可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)
最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]
同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1
（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）
注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零
MDA含量测定的改进
1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或
2.0（较好）ml。
2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。
实验2：可溶性蛋白含量
（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）
2.1所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA），考马斯亮蓝G-250 ，95%乙醇，85%磷酸
考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L，混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。
●标准曲线制作：
①标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml，制成100μg/ml的标准液，4℃下保存备用。
（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒）
②取6支具塞试管（10ml），按下表配制含0-100μg/ml的牛血清蛋白液各1ml（★调零管）
★ 1 2 3 4 5 6
蛋白标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白含量（μg）0 20 40 60 80 100
③ 各试管加入5ml G-250染色剂，翻转混合，放置2分钟，595nm 比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。
（相关系数要两个9以上）
2.2步骤：
①标准曲线（参考邹琦）（595nm 比色）
注意：制作通过原点的标准曲线，以含0μg 蛋白质液调零
②取0.1g 样品，加5ml 蒸馏水提取，5000g 离心10分钟，取上清1ml 测定
③1ml 样液+5ml G-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm 比色，直接从标准曲线读含量。
（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）
实验3：SOD 酶活性
3.1步骤：
1. 取50μl 酶液
①加入2ml 39m mol/L 甲硫氨酸（Met ）
②2ml 0.225m mol/L NBT , （氮蓝四唑）
③1ml 0.6m mol/L EDTA-Na 2（① ② ③可以配制在一个试剂瓶里）
④1ml 0.012m mol/L 核黄素，摇匀。
（现配现用）
2．（人工培养箱内）4000L χ日光灯下放置30分钟后，温度控制在30℃ ，于暗处终止反应。
（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min 转过90度，转四次。
对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）
3．560nm 处测吸光值，酶活性以抑制NBT 光反应50%为一个酶活单位表示。
（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml ，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。
）
3.2所需试剂： dl-甲硫氨酸（Met ） 39mmol/L 1.1638g/200ml NBT 0.225mmol/L (0.01840克)/ 100ml 0.0368g/200ml EDTA-Na 2 0.6mmol/L 0.0223g/100ml
核黄素 0.012mmol/L 0.0045g/L 或 0.0045g/100ml 用时稀释10倍 各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。
试验进行时一次性加5ml 的反应混合液配置方法：
Met + NBT + EDTA-Na 2
200mll+200ml+100ml
SOD 酶测定时，酶液量50μl 偏少，改为100μl 为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。
SOD 活性（酶单位u /gFW ）=(A0-A1)*V / A0*0.5*FW*a
A0---对照照光管光吸收值； A1---样品管光吸收值。
V---样液总体积（ml ）5ml FW---鲜重（g ） 1g a---测定用样品的量（ml ） 0.1ml
实验4：CAT 活性（过氧化氢酶）
4.1所需试剂：
①PBS （PH=7.0）50mmol/L （61份50mmol/l Na 2HPO 4, 39份50mmol/l NaH 2PO 4）
②15mmol/L H 2O 2(以30% H 2O 2配 )
（取85.2μL 30% H 2O 2，以50mmol/L PBS((PH 7.0)定容至100ml ）
4.2步骤：
1. 3ml 50mmol/L PBS (PH7.0)加入50μl 酶液
（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）
再加入5μl 15 mmol/L H 2O 2 摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。
2．240nm 处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）
3．CAT 活性以每分钟消耗1μmol 的H 2O 2为一个酶活单位。
活性计算改动：（以每分钟OD 值减少0.01为一个酶活单位u ）（2005和2006年均是按OD 值减少0.01算的）（以每分钟OD 值减少0.1为一个酶活单位u ）
均以50mmol/L PBS 配置 PH=7.8
注意：以PBS作空白调零50mmol/L
实验5：APX活性(抗坏血酸过氧化物酶)（即ASA—POD活性）5.1所需试剂：
ASA（分子量167.12） 0.3m mol=0.052836 (g)
(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 (以PBS配成0.1m mol/L=0.0372 (g)/L)
50m mol/L PBS (pH7.0)
9m mol/L H2O2 (以30%H2O2配制)
(51μl 30%H
2O
2
定容至100ml)
计算为：K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100
可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。
酶活性单位为μmol/g (鲜重)·min 以后APX活性测定可参考沈文飚：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨
3 ml反应液中含50 mmol/L PBS, pH7. 0, 0. 1 mmol/L EDTA（或EDTA—Na2），0. 1 mmol/L H2O2，0. 5(或0.3) mmol/L AsA，最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290 nm吸收值的变化。
以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。
室温下每分钟氧化1 umolAsA的酶量作为一个酶活性单位(U)(吸光系数为2. 8 mmol/L cm)
5.2步骤：
1.配反应液（50m mol/L PBS(pH7.0)，内含0.1m mol/L EDTA—Na2，含0.3m mol/L ASA）
2.样品池加入3ml反应液，加入50μl酶液，最后加入5μl 9mmol/L H2O2
(盖上比色杯的盖子摇匀，2—3次)
在290nm处作时间扫描，每10秒测一次，共测30秒。
（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）
3. 根据OD290值变化，计算单位时间内AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/L·cm。
），酶活性以单位时间每消耗1μmol的ASA为一个酶活单位，最后计算样品的APX活性（单位为：U/g (鲜重)·min）。
（活性计算改动）根据OD290值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASA氧化量按消光系2.8mmol/L·cm），并计算样品APX终活性。
酶活性单位为μmol/g (鲜重)·min
实验6 ASA含量测定
6.1步骤：
1.取样品母液0.2ml, 1.4ml，75mmol/l NaH2PO4 溶液（pH值7.4） (
2.34g NaH2PO4·2H2O 定容至200ml，用NaOH将pH调至7.4)混合；（75mmol/l NaH2PO4 溶液亦可用150mmol/l NaH2PO4 溶液稀释1倍得到）2.依次加入
（1）10%偏磷酸（26.3158g 38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;
（2）44%磷酸（26ml 85%磷酸 +41ml 蒸馏水）0.4ml;
( 3) 4% 2,2’----二联吡啶（称取4.0 g 2,2-二联吡啶用70%酒精定容至100ml ）0.4ml;
70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量）
3% FeCl3 0.2ml( 称取5.0g FeCl3·6H2O 定容至100ml)，摇匀，于37℃保温1.0h（5）测525nm波长下的光吸收值
4.以标准曲线方程计算ASA含量
6.2标准曲线的制作：
（1）称取10mg ASA分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；
方程。
实验7：GSH含量测定
7.1步骤：
1.取样品母液0.2ml，加入150 mmol/L NaH2PO4溶液（pH7.7）（11.70g NaH2PO4·2H2O定容至500ml 用氢氧化钠调pH至7.7）
2.6ml
2.混匀再加入0.2ml DTNB溶液（=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液 pH6.8）摇匀。
[实际配置时，称75.3×2=150.6mg ，即0.1506g DTNB溶于60ml PBS中]
3. 在30℃保温5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。
【有些文献（如龚吉蕊、於丙军）方法同样用DTNB显色，都是在常温下显色30分钟因此可将反应时间适当延长至10分钟】
7.2根据标准曲线（GSH）方程，计算GSH含量。
标准曲线制作：
1.称取100mg GSH分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。
所需试剂：
NaH2PO4 （150m mol/L）→称23.41g NaH2PO4·2H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）
DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/L PBS (PH6.8)（参照邹琦的书）
实验8：脯氨酸测定
8.1步骤：
1.取0.5g叶片，用5ml 3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g离心10分钟，上清液待测。
2.取2ml待测液，加入2ml蒸馏水，再加入2ml冰乙酸和4ml 2.5%茚三酮溶液，置沸水溶显色60min，冷却后，加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至
3.0ml 吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。
）测定520nm，波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。
8.2标准曲线制作：
1.标准液配制；准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml，再取10 ml 此液，蒸馏水定容至100ml，即为10μg·ml-1的脯氨酸标准液。
（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱也易变性）
2.取7支20ml具塞试管按下表加入各试剂
1 2 3 4 5 6 7
标准脯氨酸（ml）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
H2O（ml） 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
冰乙酸（ml） 2 2 2 2 2 2 2
显色液（ml） 4 4 4 4 4 4 4
脯含量（ug）0 2 4 8 12 16 20
3%磺基水杨酸（ml） 2 2 2 2 2 2 2
3.置沸水浴中显色60min。
冷却后（以后步骤同前）依据测定值绘制造原点标准曲线（以脯含量为0的试管作空白调零）为方程。
8.3所需试剂：
★3%磺基水杨酸水溶液（称3g磺基水杨酸，蒸馏水定容至100ml）
★甲苯★85%磷酸★冰乙酸
★2.5%酸性茚三酮显色液称取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml 6.0mol/L磷酸。
贮于棕色瓶，4℃下2~3日有效。
实际配置时，需称10g，配制400ml（其中冰乙酸240ml，磷酸160ml 6mol/L磷酸液（40.8ml 85%磷酸定容至100ml）实际配制时81.6ml定容至200ml（68ml 85%磷酸定容至1升，为1mol/L的磷酸液）
实验9过氧化氢（H2O2）含量测定方法：
参考以下文献：张峰,杨颖丽,何文亮等：盐胁迫过程中抗坏血酸对植物的保护功能。
西北植物学报2004 龚吉蕊等：干旱胁迫下几种荒漠植物植物抗氧化能力的比较研究。
西北植物学报2004
9.1步骤：
取0.5g叶片,加入预冷3%的三氯乙酸(TCA)研磨,12000g 离心20min,取1mL上清加入等体积10mmol/l 磷酸缓冲液,pH7.0,和2mL1mol/L 的KI,摇匀,390nm 测吸光值.
结果以ng·g- 1 ; Fw G表示L 用溶3% 的三氯乙酸的H2O2,50～200 ng/mL,作标准曲线
实验10超氧阴离子测定方法：。
