认识色谱柱—反相色谱柱

反相色谱C18填料
Leabharlann Baidu胶
注意： • 硅胶 颗粒大小分布 • 金属残留 • 内部孔径 • 实心核颗粒
改性硅胶
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
四乙氧基硅烷 (TEOS)
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
碱性条件下硅胶溶解
普通硅胶柱
waters改性硅胶 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
阿莫西林 初始时
停流速后 (孔去湿: ~3%)
0
2
4
6
8
10
Minutes
AQ 柱
1、极性封尾 2、极性嵌入
3、低碳载量极性保留机理：离子交换+疏水作用
4、保留硅羟基 5、增加极性嵌入键合相
对极性与非极性化合物的优异保留特性 在100％水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定 峰形优异 超低键合相流失，质谱兼容 酸性条件下稳定性良好 在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命 极佳的色谱柱间重现性 碳载量低，不适合分离复杂组份和强碱性化合物
0.00
2.00
4.00
6.00
M inutes
nortriptyline
pH 7.0
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 M inutes
8.00 10.00
amitriptyline
6.00 7.00 8.00
封端
常用封尾end-capped ： 三甲基硅氧烷
极性封尾，增加极性保留
N
+
CH3
屏蔽了带负 电的硅羟基
改善与水的浸润性－100%水溶液兼容 降低了碱性化合物的保留 降低了拖尾现象
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基呈
中性(未解离)
O-Si
O-Si OH O-Si O- Si OH
O-Si OH O-Si O- Si O-Si
阿莫西林
“湿润时”
“去湿后”
0
2
4
6
8
Vo：被分析物没有保留
此时色谱柱并没有“坏”，如何复原： –低比例有机相低流速冲洗过渡，然后高比例低流速。
10 分
疏水塌陷
极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生
内嵌极性基团键合相：
–使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定
保留时间无变化
流动相：0.1% 醋酸水溶液
宽pH 柱
硅胶柱应用禁区的有力手段
无机基质 (C18 –硅胶)
有机基质 (高聚物)
优点
• 机械强度高
• 柱效高 • 保留稳定
由于空间位阻的存在，键合反应最多 只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅 羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发 生离子交换作用，增加了保留，导致 峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基 氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减 小这种影响，这种操作被称为封尾， 封端，封口。
封端
封端
–封口残余硅羟基 –减少不可逆吸附或拖尾 –增加碳含量（0.1% -1%）
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓
• 柱寿命大大延长 •pH范围可达1~11
键合
、双、三官能团键合 三官能团键合 二官能团键合
单官能团键合
键合密度
• 碳载量 •影响残留硅羟基比率 • 键合相流失率
常见键合相
主要作用机 疏水 理
疏水 π-π 疏 疏水 水
氢键 π-π
氢键
氢键
阳离子 阴离子 交换 交换
现代色谱柱三大技术平台
纯硅胶柱
ECOSIL ODS-SH Purospher STAR RP18e Symmetry C18
亲水AQ柱
ECOSIL ODS-AQ Atlantis Dc18, T3 Synergi Hydro-RP
极性嵌入柱
ECOSIL ODS-EPS Zorbax-Bonus RP18 Symmetry shield RP18
空间位阻
空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷 增加pH范围，但有限，一般1~9
• Agilent • Phenomenex
空间位阻
• 抗水解
Agilent XDB
极性嵌入
Waters “Shield”
内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理 极性基团增加了表面层水的浓度
水 “屏蔽” 层
H3C H
OH O-Si O-Si
Base
双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作
用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
H+N(CH3)2
O-Si
O-Si O-
离子交换作用
O-Si
O-Si
OO--Si
(CH ) H+N 32
O-
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
疏水塌陷
什么是“疏水塌陷”？
低比例有机溶剂或纯 水溶液流动相
湿润的孔
C18 硅胶
未湿润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色 谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记 住：几乎所有的表面积都在孔内！
疏水塌陷
流动相：0.1% 醋酸水溶液
范围，最大耐压，筛板孔径等
内径 长度
粒径 碳载量 孔径 比表面积
材质 封端
柱效 拖尾 载样量（体积） 载样量（浓度） 分离度 回收率
你能正确连接它们吗？
填料
• 硅胶 等载体 （正相色谱） • 硅胶+键合相 （反相色谱） • 聚合物+键合相 （离子交换，手性色谱柱等） • 整体柱 （空间排阻色谱等）
电性(大部解离)
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
既然pH< 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情 况下采用酸性条件进行分离?
低pH可导致分离选择性的丧失!---碱性基团离子化，极性增加
AU
AU
0.04
pH 2.0
0.02
0.00 0.00
0.04 0.03 0.02 0.01 0.00
HILIC柱
Zic-HILIC Hypersil GOLD HILIC Atlantis HILIC 柱
目的：改善峰形
目的：提高极性化合物 保留
宽pH色谱柱
ECOSIL ODS-Extend Xbridge/Xterra C18/C8 Gemini C18 Zorbax Extend
目的：提高色谱柱pH使 用范围
色谱分离基本原理
“两相分配，相似相溶”
色谱柱结构
色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。 筛板的内部孔形态会影响柱效
规格
Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm 5um
• 表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径 • 隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH