分子生物学技术新进展

分子生物学技术新进展
分子生物学技术新进展
二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和 疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生 物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技 术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基 因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研 究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医 学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面， 分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。
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分子生物技术概述
分子生物技术也称之为生物工程，是现代生 物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、 细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、 酶工程技术等。重组DNA技术是现代分子生物 技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程 (Gene Engineering)的核心技术。
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基本原理与过程：
1、分离纯化目的基因 2、目的基因 + vector =重组DNA分子 3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞 克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同 的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液 体培养基中进行扩增。 5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA。
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（三）实时定量PCR (real-time PCR)技术
是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
（三）DNA和RNA的微量分析
PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是 DNA和RNA微量分析的最好方法。
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（四）DNA序列测定 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作 大为简化，也提高了测序的速度；
（五）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检 测的敏感性 。
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（二）原位PCR技术
原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定 标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片 中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示 结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测， 可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中 存在。
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重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 18661944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传
工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
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目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位 DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧 光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子 特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。 此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒 感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检 查等。
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三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将 RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术， 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序 列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。
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重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）
是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体 外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染 入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基 因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合 的DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆。 (常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC， YAC，PI等)。
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以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
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重组DNA技术的目的
• 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基 因扩增，获得足够量的目的基因来进行 结构与功能的研究。
• 重组DNA技术的另一目的是获得基因 重组后的产物——RNA，蛋白质。
• 将目的基因与表达载体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋 白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的 抗原和特异的抗体等。
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重组DNA和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源）
1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆
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PCR体系基本组成成分和步骤
•模板DNA
•特异性引物
•耐热DNA聚合酶
•dNTPs •Mg 2+
延伸 72˚C
变性 95˚C
退火 Tm-5˚C
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聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）
Template DNA
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Primer 1
5 Primer 2
Cycle 1
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Cycle 2
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Cycle 3
5Baidu Nhomakorabea
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
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二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片 段进行嵌和、缺失、点突变等改造。