免疫组化和免疫荧光染色
免疫组化和免疫荧光染色是生物医学领域常用的实验技术，用于检测和定位特定抗原或蛋白质在细胞或组织中的表达情况。本文将分别介绍免疫组化和免疫荧光染色的原理、步骤和应用。
一、免疫组化
免疫组化是通过特异性抗体与特定抗原的特异性结合来检测和定位抗原或蛋白质的表达情况。其原理是利用抗体的高度特异性与抗原结合，然后通过酶标记与抗体结合的抗原-抗体复合物，通过酶的催化作用生成可见的染色产物，从而实现对抗原或蛋白质的检测和定位。
免疫组化的步骤包括：组织固定、抗原恢复、非特异性结合抑制、一抗和二抗结合、酶标记结合、染色和显色。首先，将待检组织固定在载玻片上，然后进行抗原恢复，以使抗原处于良好的检测状态。接着，通过非特异性结合抑制，阻断非特异性背景结合。然后，加入一抗和二抗，使其与特定抗原结合。随后，加入酶标记的二抗，形成抗原-一抗-二抗-酶标记的复合物。最后，通过染色和显色步骤，观察和记录抗原或蛋白质的表达情况。
免疫组化在病理诊断、生物学研究和药物研发等领域具有广泛应用。在病理诊断中，免疫组化可以帮助鉴别肿瘤类型、评估预后和指导治疗方案。在生物学研究中，免疫组化可以对细胞和组织中的蛋白质进行定位和表达分析，从而揭示生物学过程和疾病机制。在药物
研发中，免疫组化可以用于药物靶点的筛选和药效评价，从而加速新药的开发过程。
二、免疫荧光染色
免疫荧光染色是利用特异性抗体与特定抗原结合后，通过荧光标记的二抗来检测和定位抗原或蛋白质的表达情况。其原理是将抗原-抗体复合物与荧光标记的二抗结合，形成荧光标记的抗原-一抗-二抗复合物，通过荧光显微镜观察和记录。
免疫荧光染色的步骤与免疫组化类似，也包括组织固定、抗原恢复、非特异性结合抑制、一抗和二抗结合等步骤。不同之处在于，在免疫荧光染色中，二抗是标记有荧光染料的抗体。通过荧光显微镜观察，荧光信号可以直观地显示抗原或蛋白质的定位和表达情况。
免疫荧光染色在生物医学研究中广泛应用。它可以用于检测细胞中特定蛋白质的表达、定位和分布情况，从而揭示细胞功能和疾病机制。在免疫组化无法满足需求的情况下，免疫荧光染色可以提供更高的灵敏度和空间分辨率。
免疫组化和免疫荧光染色是生物医学领域中常用的实验技术。它们通过特异性抗体与特定抗原的结合，实现对抗原或蛋白质的检测和定位。免疫组化和免疫荧光染色在病理诊断、生物学研究和药物研发等领域具有广泛应用，为科学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
免疫荧光染色（全程避光） （1）切片晾干后用0.01mol/L PBS（PH值7.2－7.4）漂洗10min×3次；（2）0. 3％Trion-100溶液37℃25min；0.01mol/LPBS漂洗10min×3次； （3）滴加5％BSA37℃封闭抗原25min，甩去多余液体，不洗；（4）滴加用1％封闭血清稀释的一抗50ul/张，置4℃冰箱40－48hr。 PBS洗10min×3次； （5）滴加1％封闭血清稀释的荧光二抗羊抗兔，室温下2h；PBS洗5min×2次；晾干，60％甘油封片。 荧光双标步骤同上，仅在滴加一抗和二抗时分别将两种一抗和二抗一起加入。但两种一抗需种属来源不同。 1.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min 2. 3 mL/L Triton X-100漂洗10 min。 3.正常羊血清封闭30 min。 4.一标一抗兔抗GFAP (北京中杉)孵育液,稀释度为1∶50，37℃孵育1 h,室温过夜（室温24~48 h）。 5.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min， 6.加入FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉)荧光二抗,稀释度为1： 50,37℃孵育1 h，0.01 mol/LPBS洗10×3 min。 7.捞片,阴干,甘油封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例) 1.冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟， PBS洗，5分钟×3。 2.用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3.PBS洗，5分钟×2。 4.5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5.PBS冲洗，5分钟×3次。 6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃ 孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 7.PBS冲洗，5分钟×3次。 8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵 育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 9.PBS冲洗，5分钟×3次。 10.显色剂显色（DAB或AEC）。 11.自来水充分冲洗，复染，封片。 另外是否做冰冻或者石蜡是有你所要检测的蛋白来决定的，买一抗的时候有要求。如果能做石蜡的话，虽然复杂点，但做出来的组织结构比冰冻的清晰，更好看。
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们 在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。虽然它们都是用于检测特 定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上 却有着明显的区别。在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并 就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地 理解并灵活运用这两种技术。 1. 免疫组化法 免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。它的 操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。在实验过程中，首先需要将 样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性 染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。 2. 免疫荧光染色法 免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号 的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。它的操作流程也包 括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤 较为类似。不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标
记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。 在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特 定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适 用于体内和体外实验样本。而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分 辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋 白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的 技术手段。 在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、 步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。 通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学 研究。 总结回顾，免疫组化法和免疫荧光染色法是两种常用的生物医学实验 技术，它们在检测蛋白表达和定位上有着各自的特点和优势。通过深 入理解这两种技术的原理和操作方法，我们可以更好地利用它们来开 展生物医学研究，为科学研究和临床诊断提供有力的技术支持。希望 本文能够帮助读者更深入地了解免疫组化法和免疫荧光染色法，并在 科研实践中得到有益的启发和帮助。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别 免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学研究中常用的实验技术方法。它们都是通过利用抗体与目标抗原的特异性结合来检测和定位特定蛋 白质在细胞或组织中的表达情况。尽管它们的目的相似，但在具体实 验步骤、原理和应用方面存在一些差异。本文将对免疫组化法和免疫 荧光染色法的区别进行详细阐述，以帮助读者更好地理解这两种常见 实验技术。 一、实验步骤和原理 1.免疫组化法： 免疫组化法是一种通过使用抗原与特异性抗体相结合的技术，将抗体 标记物（一般为酶）转化为可见信号，并用于检测和分析目标分子在 细胞或组织中的表达情况。其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合、再次洗涤和显色等。 2.免疫荧光染色法： 免疫荧光染色法是利用荧光标记的抗体来检测和定位目标抗原的一种
技术。其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合和荧光染色等。 从实验步骤和原理上看，免疫组化法和免疫荧光染色法在很多方面是 相似的。它们都需要进行对抗原的取样和固定等预处理步骤，以及对 目标抗原的特异性抗体进行结合。然而，主要的区别在于信号检测和 可见性。免疫组化法使用酶标记物并在显色反应中产生可见的染色物质，而免疫荧光染色法则通过荧光标记的抗体在荧光显微镜下进行直 接可视化。 二、应用领域 1.免疫组化法： 免疫组化法广泛应用于细胞生物学和组织学研究中，常用的应用领域 包括但不限于肿瘤标记、蛋白质表达和定位、细胞内分子信号通路等。 2.免疫荧光染色法： 免疫荧光染色法在细胞和组织研究中具有重要作用。它常用于细胞活 力检测、细胞分子定位、免疫分型、细胞凋亡检测等。 免疫组化法更适合定性分析和形态学研究，而免疫荧光染色法则更适
常用免疫组织化学染色方法 免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质 的染色方法。它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生 物学、细胞生物学、病理学等领域。以下是一些常用的免疫组织化学染色 方法介绍： 1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)： 免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使 用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色 方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗 原以及胞内蛋白质的定位。 2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)： 免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。它可以提供高度 特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互 作用等。利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复 合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。 3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)： 免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位 特定抗原的方法。通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显 微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。这种方法具有高分辨率和高特异 性的优点，广泛应用于超微结构的研究。 4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：
免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的 抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。常用的标记物包括辣根过 氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。在检测抗原时，标记物可以与染色 底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。 5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)： 免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。它能够同时检测细胞中的特定mRNA和蛋白质表达，可以用于研究基因表 达调控、细胞特异性、发育过程和肿瘤等方面。 综上所述，免疫组织化学染色方法在生物医学研究中发挥着重要作用。通过这些方法，可以对生物样本中特定蛋白质的表达和定位进行研究。不 同的染色方法具有各自的优缺点，选择适合的方法可以更好地满足研究需要。此外，不断改进和创新免疫组织化学染色方法也为生物医学研究提供 了更多的可能性。
免疫组化,免疫荧光 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和免疫荧光（immunofluorescence，IF）是现代生物医学研究中非常重要的技术 手段。它们能够帮助研究人员检测和定位体内特定的抗原分子，从而 解析其在生物体内的表达及分布情况。在研究疾病机制、诊断疾病以 及筛选新药的过程中，免疫组化和免疫荧光技术起到了至关重要的作用。 免疫组化技术利用抗体的高度特异性与抗原结合的原则，通过显 色或荧光等方式便于观察和定量，从而实现对特定蛋白分子的检测。 与传统的组织学染色方法相比，免疫组化技术具有更高的灵敏性和特 异性。它可以用于研究肿瘤细胞的表型和基因型，识别细胞类型和分 化状态，表达和分布丰度评估等方面。 免疫组化的步骤一般分为抗原解表、抗体孵育、二抗复合、显色/ 荧光和显微镜观察等几个关键步骤。首先，需要对组织样本进行固定 和包埋处理，以保证组织结构的完整性。然后，通过切片和石蜡脱脂 等处理，将样本表面的蛋白质解表，暴露出所需的抗原位点。接下来，
将特异性的抗体与样本中的抗原结合，以形成特定的抗原-抗体复合物。之后，通过孵育次级抗体，将荧光染料或酶标记物与抗原-抗体复合物 结合，以便于后续的检测和可视化。最后，利用显微镜观察样本，并 根据染色或荧光信号分析目标蛋白的表达和分布情况。 免疫荧光技术与免疫组化技术类似，但其主要用于可视化荧光信号。在免疫荧光技术中，孵育过程中的抗原-抗体复合物会被荧光标记 的二抗所结合，从而形成荧光信号。这种信号可以直接通过荧光显微 镜观察，也可以通过激光共聚焦显微镜等高分辨率成像设备进行观察 和记录。免疫荧光技术适用于检测蛋白质在细胞和组织中的分布、定 位以及与其他蛋白质的相互作用等方面的研究。 总的来说，免疫组化和免疫荧光技术在现代生物医学研究中发挥 着重要的作用。它们可以帮助我们了解细胞和组织中特定蛋白质的表 达和分布情况，进而揭示疾病的发生机制和药物的作用机理。在临床 诊断中，免疫组化和免疫荧光技术也可以提供重要的辅助信息，用于 疾病的鉴别诊断和预后评估。随着科学技术的不断进步，免疫组化和 免疫荧光技术将进一步发展，并为生物医学领域的研究和临床应用提 供更多新的机会和挑战。
免疫荧光和免疫组化是生物医学领域中常用的实验技术，它们在研究 细胞和组织中蛋白质的表达和定位方面都发挥着重要作用。虽然它们 在某些方面有相似之处，但在其他方面又有明显的不同。接下来，我 将从深度和广度两个方面对免疫荧光和免疫组化进行全面评估，并撰 写一篇高质量、深度和广度兼具的文章，以便您能更加全面、深刻地 理解这两种实验技术。 深度上看，免疫荧光和免疫组化都是通过特异性的抗体与待检测蛋白 质结合，从而实现对蛋白质检测的技术手段。在免疫荧光中，待检测 的蛋白质通常会与荧光素标记的抗体结合，形成荧光复合物，通过荧 光显微镜或流式细胞术等来观察和分析。而在免疫组化中，通过酶标 记的二抗结合来对蛋白质进行检测，进而通过染色反应观察和分析。 两者均能够实现对蛋白质的高度特异性检测，但在技术操作和结果分 析方面存在着一定的差异。 在广度上看，免疫荧光和免疫组化在研究领域中的应用也存在差异。 免疫荧光广泛应用于细胞生物学和免疫学研究中，因其高灵敏度和高 分辨率的特点，常用于检测和定位细胞内蛋白质的表达和分布情况。 而免疫组化则更多用于组织学研究中，通过对组织切片进行染色反应，实现对蛋白质在组织结构中的定位和表达水平的分析。两者在生物医 学研究中各有侧重，但都对蛋白质研究提供了重要的技术支持。 免疫荧光和免疫组化在原理和应用上存在着一定的相似性和差异性。
深度上看，它们在技术操作和结果分析方面具有明显的差异；广度上看，它们在生物医学研究领域中的应用也存在差异。然而，无论是免 疫荧光还是免疫组化，都为蛋白质检测和定位提供了重要的实验手段，对于生物医学领域的发展具有重要意义。 在我的个人观点和理解方面，我认为免疫荧光和免疫组化作为生物医 学研究中常用的实验技术，虽然在原理和应用上存在差异，但在实际 研究中往往需要根据具体的研究目的和对象选取合适的技术手段。在 未来的研究中，可以通过结合这两种技术手段，实现对蛋白质表达和 定位的更全面和深入的研究，为生物医学领域的发展提供更多的可能性。 在本篇文章中，我从深度和广度两个方面全面评估了免疫荧光和免疫 组化这两种生物医学研究中常用的实验技术，同时也共享了对这两种 技术的个人观点和理解。希望这篇文章能够帮助您更加全面、深刻地 理解免疫荧光和免疫组化这两种重要的实验技术。免疫荧光和免疫组 化作为常见的实验技术，具有其独特的优势和应用价值。免疫荧光在 细胞生物学和免疫学研究中被广泛应用，它能够通过荧光显微镜或流 式细胞仪观察和分析待检测蛋白质的表达及分布情况。通过荧光标记 的抗体与待检测蛋白结合形成荧光复合物，使得目标蛋白在细胞中的 分布情况可以被直观地观察到，为细胞内蛋白质研究提供了重要的技 术手段。另免疫组化则更多用于组织学研究中，通过对组织切片进行 染色反应，对待检测蛋白的表达和定位进行观察和分析。通过酶标记
免疫组化染色操作步骤 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织学上，通过 对细胞和组织中一些免疫反应物的特异性染色来研究蛋白质表达和分布的 方法。免疫组化染色操作步骤一般包括以下几个主要步骤：组织固定、切片、抗原修复、抗原阻断、一抗和二抗染色、显色反应和染色质反应控制。下面将详细介绍每个步骤。 一、组织固定 组织固定是将新鲜组织固定在组织学玻片上以保持其形态和结构。常 用的固定剂有甲醛和乙酸（酒精）。固定剂的选择应根据研究目的和检测 的抗原选择合适的固定剂。甲醛固定对细胞膜蛋白质有较好的保护作用， 适用于一些膜蛋白的免疫染色；而乙酸（酒精）固定可以在较短时间内固 定组织，适用于快速染色的情况。 二、切片 固定好的组织需要进行切片处理，将其切割成5-10微米厚的切片。 常用的器械有冰冻刀、滑刀等。冰冻刀用于切割冰冻组织，滑刀用于切割 固定组织。切割好的组织切片需要进行干燥处理。 三、抗原修复 抗原修复是为了恢复组织中被固定剂破坏的抗原形态。抗原修复的方 法一般有热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复两种。热诱导抗原修复是将切 片浸泡在高温的缓冲液中进行加热处理，常用的缓冲液有PBS、Tris等。 酶诱导抗原修复是通过加入蛋白酶K等酶来修复抗原。 四、抗原阻断
抗原阻断是为了阻止非特异性的结合，减少假阳性结果。一般是通过 加入牛血清白蛋白（BSA）或小鼠IgG等蛋白质来阻断非特异性结合位点。 五、一抗和二抗染色 一抗是指充分体内或体外免疫后所制备的单克隆或多克隆抗体。在进 行一抗染色前，需要对切片进行预处理，如使用过氧化氢或金胶子等对内 源性酶进行体外灭活。一抗的稀释倍数需要根据标示规定，也可以进行实 验室优化。一般在4℃下孵育过夜。第二天，用PBS进行洗涤后加入二抗。二抗是对一抗的特异性抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。加入二 抗后，需要进行适当时间的孵育，一般是30分钟到1小时，然后用PBS 进行洗涤。 六、显色反应 显色反应是为了检测所免疫染色的反应物。常用的显色反应方法有酶 标法、免疫荧光法和光显微镜法。其中，酶标法是最常用的方法之一、它 是通过一系列的反应，使染色物质在局部区域生成可见的颜色。常见的染 色物质有DAB、VIP、BCIP/NBT等。免疫荧光法是通过在组织切片上染色 荧光标记的抗体，然后使用荧光显微镜观察染色结果。光显微镜法是通过 光显微镜观察染色结果。 七、染色质反应控制 染色质反应控制主要是为了确定染色质的质量和结果的准确性。常见 的染色质反应控制方法有阳性对照、阴性对照和替代染色质。阳性对照是 使用已知阳性样品进行染色，以确认试剂和方法的效果。阴性对照是使用 与待检组织相同的组织但无表达目标抗原的组织，以确认试剂和方法的特
脑片免疫荧光和免疫组化实验步骤 一、脑片免疫荧光实验步骤 1. 选择适当的脑片：根据实验目的，选择适当的脑组织样本，并将其切片，厚度通常为20-50微米。 2. 取样品：将脑片放置在玻璃载玻片上，用磨刀机或刮片仪取出样品。将脑片固定在载玻片上，并确保其平整。 3. 抗体处理：用适当的抗体针对感兴趣的分子进行标记。可以使用一种或多种特异性抗体来检测不同的分子。 4. 渗透：将抗体溶液加入载玻片上的脑片样品上，并确保完全渗透。根据实验需要，可以进行不同时间的渗透，通常为1-2小时。 5. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。洗涤次数和时间根据实验需求而定，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤5-10分钟。 6. 荧光染色：加入适当的荧光染料，与抗体结合的目标分子将发出荧光信号。根据荧光染料的性质和实验需求，可以选择单一染色或多重染色。 7. 透明化：使用适当的透明化剂，如甘油或聚乙烯醇，使样品透明，以利于观察和成像。 8. 成像和分析：将样品放置在荧光显微镜下进行观察和成像。可以
使用适当的成像软件对图像进行分析和处理，以获取所需的数据。 二、脑片免疫组化实验步骤 1. 取样品：选择适当的脑组织样本，并将其切片，厚度通常为20-50微米。将脑片放置在载玻片上。 2. 固定：用适当的固定剂固定脑片样本，以便后续的处理。常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。 3. 脱脂和脱水：将脑片样本依次浸入不同浓度的醇溶液中，使其逐渐脱脂和脱水。常用的醇溶液包括乙醇和丙酮。 4. 抗体处理：用适当的抗体针对感兴趣的分子进行标记。可以使用一种或多种特异性抗体来检测不同的分子。 5. 渗透和洗涤：将抗体溶液加入载玻片上的脑片样品上，并确保完全渗透。根据实验需要，可以进行不同时间的渗透，通常为1-2小时。然后用洗涤缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。 6. 染色：使用适当的染色剂，如DAB（二氨基联苯胺）或HRP（辣根过氧化物酶），与抗体结合的目标分子将呈现棕黑色或其他颜色。 7. 对比染色：为了增强对比度和观察效果，可以使用对比染色剂，如尼格霍德。 8. 封片：将样品覆盖用透明封片封住，以保护样品并方便观察。
免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片： 脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。 抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。2. 固定 可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。 3. 封闭(Blocking) 加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。 从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。 用微型台式真空泵(EVAC06/EV AC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。 回收一抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？ 作者：北京义翘神州 在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。 从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此，才会延伸出三个相近的概念。 为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光 Immunofluorescence (IF)。 词根分析： Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合） Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质） Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质） Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化） Fluorescence-对被激发的荧光团的检测 通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。 这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。而常用的方法就是化学显色和荧光显色。如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。 其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。 可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？
免疫荧光三色染色步骤 免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。 下面是免疫荧光三色染色的步骤： 1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。 2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。 3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。 4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。 5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗
兔的抗体。二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。 6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。 7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。 8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。 通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。 需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。 免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。
免疫荧光和免疫组化 问题如下： 1. 免疫荧光好还是做免疫组化好？我倾向于做免疫组化，但老板倾向做荧光，我想两种方法都了解一下，能否介绍一下两种方法的详细步骤（protocol）。 2. 一抗、二抗抗体（包括荧光抗体）如何选择，哪个公司的比较好？浓度怎么掌握？ 其实IHC和IFC本质都是一样的。只是最后的显色方法不一样，IHC是用酶加底物进行显色反应，用普通光镜观察；IFC是直接用带有荧光物质连接的二抗与一抗结合，在相应波长的激发光下观察。 我也倾向于IHC，理由如下： IHC的级联放大作用使得抗原比较少的组织也能有很强的着色。我一般用Vector公司的Elite系列ABC kit，HRP－DAB显色系统。 IHC的切片可以长期保存。很多时候试验做出来了，需要反复的看片子。而IFC的有荧光猝灭，无法长久保存。所以不利于反复阅片。 IFC有利于做Multiple Labeling，比如在同一location的两种或多种抗原的比较，通常用IFC；IFC还多用于活细胞的staining，但如果是石蜡切片，总会有一些自发荧光现象存在。所以个人认为，能用IHC的时候建议不用IFC。 详细protocol请在本版内search一下，已经有很多的讨论了。 一抗通常买DAKO、SIGMA、VECTOR，二抗可以选择相应公司的，也可以买SANTA CRUZ的，比较便宜一些。荧光二抗建议买
Molecular Probe的，现在和Invitrogen合并了。 浓度先参考data sheet上的，不过还是自己要optimize一下，比如建立个浓度梯度。阴性对照用相同种属来源动物的IgG。 供参考。 GOOD LUCK! 免疫荧光结果分析及抗体选择——许多问题你思考过吗？ https://www.doczj.com/doc/8519180552.html,/bbs/topic/24548838?keywords=%E5%85 %8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%E7%BB%93%E6% 9E%9C%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7 %96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97 免疫荧光因其直观、色彩鲜明而被广泛用于检测各种蛋白的定位表达。 （1）免疫单标 此时与免疫组化的用途相近，仅能检测待测蛋白在细胞中的表达部位，如细胞核，细胞浆及细胞膜。 疑问：许多蛋白既在细胞核又在细胞浆表达，某蛋白活性发生变化后主要表现在该蛋白在细胞核与细胞浆存在表达量的差异（如NF-KB/ERK等）。因此某些实验的研究目的就是观察某种干预后这些蛋白是否存在活性的变化。针对这种细胞核和细胞浆均存在蛋白表达的蛋白质分子，单一的免疫荧光是否能说明问题，是否需要DAPI染色协助说明该蛋白的细胞定位？此时会出现多种可能，（1）两种染色不重合（不同细胞分别染色）；（2）两种染色重合但不叠加（同一细胞分别在细胞核DAPI染色和细胞浆待测蛋白染色）；（3）两种染色叠加
检验科免疫组化常见检测与分析方法免疫组化技术是一种利用免疫学原理，通过检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平和位置的方法。在医学检验科中，免疫组化技术被广泛应用于疾病的诊断、治疗及预后评估。本文将介绍一些常见的免疫组化检测与分析方法。 一、免疫组化染色法 免疫组化染色法是免疫组化技术中最常用的方法之一。它通过采用免疫荧光、酶标记、金标记或放射性标记等技术，将特定抗原与特异性抗体结合，并通过染色或荧光的方式来显示其位置和表达水平。免疫组化染色法广泛应用于各种疾病的诊断，如肿瘤标记物的检测、感染性疾病的诊断等。 二、免疫组织化学法 免疫组织化学法是一种在组织切片上进行免疫组化染色的方法。它通过对切片进行蛋白质抗原的恢复处理和抗体的特异性结合，来检测和显示抗原在组织中的位置和表达水平。免疫组织化学法主要应用于病理学领域，帮助医生确定疾病的类型和分级。 三、免疫荧光法 免疫荧光法是利用特异性抗体与抗原结合后，在显微镜下观察抗原在组织或细胞中的分布情况和表达水平的技术。免疫荧光法具有高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于自身免疫性疾病、感染性疾病等的诊断。
四、免疫电镜法 免疫电镜法是一种在电镜下观察和检测抗体与抗原结合的方法。它 通过在样品上标记抗体或抗原，然后利用电镜来观察并获得高分辨率 的图像。免疫电镜法主要用于对超微结构进行研究和观察，是研究细 胞和组织的重要手段。 五、免疫组化信号放大技术 免疫组化信号放大技术是一种能够放大免疫染色信号并提高染色效 果的方法。常见的免疫组化信号放大技术包括多聚酶法、银增强法、 酶蛋白复合物法等。这些技术在免疫组化检测中可以提高检测的灵敏 度和准确性。 免疫组化技术因其高度敏感、高特异性和定量分析的优势，成为了 疾病诊断与治疗中不可或缺的重要方法。随着技术的发展和创新，免 疫组化技术将在临床医学中发挥越来越重要的作用。 综上所述，本文介绍了免疫组化检测与分析的常见方法，包括免疫 组化染色法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫电镜法以及免疫组 化信号放大技术。这些方法在医学检验科中的应用十分广泛，为疾病 的诊断和治疗提供了重要的支持和帮助。随着技术的不断创新和进步，相信免疫组化技术将在未来发展出更加高效、准确的检测方法，为人 类健康服务。
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。
免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。 免疫组化： 是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 Elisa（酶联免疫吸附试验）： 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。 免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。 western bolt：
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin’s固定RT2h（6-8dtesis）orRT过夜（成年tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4-10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于4?C70%乙醇中的组织样品 ? 80%乙醇15min ? 95%乙醇15min ? 100%乙醇15min?2 ? 1/2乙醇1/2二甲苯15min ? 二甲苯透明5-10min ? 1/2二甲苯1/2石蜡30min ? 石蜡（1） ? 石蜡（2）石蜡（3）包埋 ? RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 ? 二甲苯(1)20min ? 二甲苯(2)20min ? 100%乙醇20min ? 95%乙醇10min ? 80%乙醇10min ?
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ? 切片在PBS中浸泡5min*2 ? %TritonxRT10min ? 切片在PBS中浸泡5min*3 3%H2O2RT10min 切片在PBS中浸泡5min*3 %胰酶RT10min 切片在PBS中浸泡5min*3 Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100inPBS)RT60min 倾去blockingbuffer，勿洗 一抗4?Covernightinblockingbuffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡5min*3 二抗inblockingbufferGAR1：200（GAM1：100），RT1h 切片在PBS中浸泡5min*3 DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s， 玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深，可用盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久） 脱水85%乙醇5min ? 95%乙醇5min ? 无水乙醇5min ? 无水乙醇5min ? 二甲苯(1)10min ? 二甲苯(2)10min ? 中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片的免疫荧光方法： 密封保存于RT的组织切片 ? 二甲苯(1)20min ? 二甲苯(2)20min ? 100%乙醇20min ? 95%乙醇10min