沉淀分离技术

调 pH在等电点并不产生沉淀。
等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合
使用；
在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意
防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸
等弱酸和碳酸钠等弱碱。
中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有
所增大。
其他沉析技术
一、金属离子沉析 二、有机酸沉析 三、选择变性沉析
１） 金属离子沉淀
▪ 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起 反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白 质的溶解度。
▪ 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的 认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得 到的。
优点：
1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而 PEG 通常一般不影响下一步的分离。
离子型聚电解质沉淀
机理：架桥与静电 离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白
的沉淀。 合成的离子聚合物：
聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺
蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍
有机溶剂沉淀法的影响因素
1、温度
使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有
机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10－-20℃；在使用有机溶剂沉淀生物高分子
思考 题
含量=酪蛋白g/100mL牛乳
思考 题
实例剖析2
原理
乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶
将提取液加入1％的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压滤机。过滤后 得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去
思考 题
实例剖析3 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质
原理
1、取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS 100ml搅拌 10min。
7、在搅拌下，慢慢滴加43ml～50ml饱和硫酸铵溶液，约达30%～ 33%饱和度。
8、离心（3500r/min）20min得上清液（含β-球蛋白）和沉淀（主 要含γ-球蛋白）。
9、取5中上清液在搅拌下，慢慢滴加35ml～40ml饱和硫酸铵溶液， 饱和度约达45%。
10、离心（3500r/min）20min得上清液（主要为α-球蛋白）和 沉淀（主要为β-球蛋白）。
5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白
质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，
并降低溶剂用量。
举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究
α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水
过滤
水抽提清液
加乙醇（70%）搅拌
α-淀粉酶↓
* pH影响
收率%
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作 用，是较早使用的沉淀方法之一。
优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓 度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；
缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进 行。3）成本高
➢ Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。 ➢ Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。 ➢ 硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于， ➢ MgSO4用以去除DNA和其他核酸；
金属离子沉淀蛋白质
▪ 一般可分三类： ▪ ①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离
清液，得酪蛋白粗制品。 4、用水洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液
5、在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏 漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2 次，抽干。
6、将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。 7、准确称量，计算含量和收率。
时，整个操作过程应在低温下进行 。
有机溶剂沉淀法的影响因素
2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。
3、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共 沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。
4、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一 般中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化 钠等。
在一定pH值下易变性的杂蛋白。
实例剖析1 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白
1、将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别 水浴加热40℃
左右。并用8层纱布过滤牛奶。 2、量取加热后的牛奶20ml。在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠
缓冲液20ml。用酸度计调pH至4.7。 3、将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上
2、在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液。 3、加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20~30min以充分沉淀球蛋白。 4、离心（3500r/min） 20min，弃去上清液（主要含清蛋白），
沉淀中含有各种球蛋白。
6、取5中沉淀溶于PBS中使体积达100ml并转移至250ml烧杯中搅 拌15min。
碱变性。
选择性变性沉淀法
选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以
在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理
化学性质等有比较全面的了解。
例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大
多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。
选择性分离核酸
酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-
等电点沉淀法
等电点沉淀法
❖ 细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%）
❖ 调pH5.0-5.5，低温离心 上清液调pH4.8- 5.1产物↓
❖
沉淀（杂蛋白）
等电点沉淀法注意事项
本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗
大的凝聚物。
但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，
第六章 沉淀分离技术 （precipitation)
生物分离过程的一般流程
沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。
酶活 酶活
收率
6.5
pH
* 适宜的pH 5.6 ~ 6.0
* 温度影响
收率%
酶活 酶活
10
20
* 适宜的温度10 ~ 20 ℃
收率 T℃
等电点沉淀法
iso-electric point precipitation 等电点沉淀法
生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白 质
有机聚合物沉析
非离子型聚合物
用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性
的沉淀蛋白质。
机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)： 是一种水
溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用来沉淀 蛋白质。
概述
❖ 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心以后进行，得到的沉析物可直接 干燥制得成品或经进一步提纯制得高纯度生化产品
❖盐析 ❖有机溶剂沉析 ❖等电点沉析 ❖有机聚合物沉析 ❖其他沉析技术
盐析
Salt induced precipitation
盐析机理示意图
盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高
浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而
沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。
（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电
荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
子，如：Mn2+、 Fe2+ 、 Ｃo2+、 Ni2+ 、 Ｃu2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ; ▪ ②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+ 、 Ba2+、
Mg2+ 、 Pb2+ ; ▪ ③能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：Ｈg2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 ▪ 实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，
可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。
实例
三、选择性变性沉淀法
❖ 选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂 质变性沉淀下来，而与目的物分开。
❖ 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏 感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。
❖ 方法可分为：1）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；2） 利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸
❖有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，
有时也用于蛋白质沉淀。
❖等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用
较少，多与其它方法结合使用。
❖非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。
源自文库
❖生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。
❖选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和
n 成本低，不需要特别昂贵的设备。 n 操作简单、安全。 n 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化
蛋白质。 n 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它
的纯化方法。
有机溶剂沉淀法 organic solvent precipitation
有机溶剂沉淀法
概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度， 使其沉淀析出
水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，在DNA、RNA
在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去； 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。
各种沉淀方法应用范围
❖盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。