（生物科技行业）分子生物
学实验指导
分子生物学实验指导
动植物检疫专业
2012，2
分子生物学实验注意事项
1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，壹定要做好统筹安排。3．实验课中的所有单项实验都属于壹个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，壹切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。
4．实验的每壹步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！
5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
6．写作实验报告或实验论文壹定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。7．在实验室内不能大声喧哗。
8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面壹角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐且清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验壹质粒DNA的提取
1．目的
学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理
根据共价闭合环状质粒DNA和线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0 12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但俩条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在壹起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA壹起沉淀下去。
3．器材
超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
4．试剂
pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。
5．实验准备
氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200μL5NNaOH 调pH至7.0，加ddwater至1L，121︒C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20︒C 保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA （RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净且盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，壹起高压灭菌（121︒C30min）。
6．操作步骤
（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。
（2）从超低温冰箱中取出保存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮壹下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌壹下，37︒C摇床中摇20h。
（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。
（4）在沉淀中加入100μl溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取壹个塑料盒，装上适量的冰块备用。）
（5）加入200μl溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（6）加入150μl溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（7）15000rpm离心5min，小心吸取400μl上清液于另壹个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。
（8）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净
（9）再加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净
（10）离心管倒置于37︒C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎见不见！）。
（11）pMD18-T-F加入30μl无菌蒸馏水或TE缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块壹起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告
7．思考
（1）影响本实验结果的因素有哪些？
实验二、质粒DNA的酶切
1．目的
学会用限制性内切酶切割质粒DNA。
2．原理
II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列且在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。
4．试剂
pMD18-T-F质粒，EcoRI，BamHI，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（50⨯储存液），1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10⨯加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）
6．操作步骤
（1）混合下列溶液于壹个无菌的1.5ml微量离心管中：
pMD18-T-FDNA(或pUCm-T-F)6μL
10×酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液）2μL
ddwater30μL
EcoRI1μL
BamHI1μL
总体积40μL
（2）先准备壹个冰盒且放入壹定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。
（3）用壹只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另壹只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1μL限制性内切酶。
（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h（壹般是37℃）。
（5）酶切后取少量酶切产物和合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
（6）酶切后的质粒能够回收备用。
（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。
7．思考
（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？
（2）如何估计DNA用量和酶的用量？
