蛋白质双向电泳简介

长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生 水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需 要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围 和胶条长度来确定。
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解 性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质 变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基
因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰 双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂 类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导 致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制 备的药剂必须与等电聚焦兼容。
样品的溶解ห้องสมุดไป่ตู้
2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶 解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复 合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的 溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可 能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单 个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必 须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖 和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样 品在电泳过程中保持溶解状态。
胶条水合
首先,要选好IPG干胶条的pH梯度。对一个新样品,最 先使用宽范围、线性pH 3.5~10梯度。但对大多数样 品,这样做可能会降低pH 4~7区域的分辨率,因为许多 蛋白质的pI值分布在该区域。利用非线性的pH 3.5~10 IPG干胶条在一定程度上缓解了这个问题。非 线性pH 3.5~10的胶条在pH4~7区域的梯度比pH 7~10更为平坦,保证在大部分碱性蛋白质都能得到分 辨的前提下,pH 4~7区域能得到更好的分离。若用 pH4 ~7的IPG胶条则能在该范围得到更好的分离效果。 等电聚焦在样品裂解液中运行。IPG干胶条使用前必 须在样品溶液中水合。水合期间,蛋白样品进入IPG胶 条,并分布于整个聚焦介质中,该技术实用且易操作。 此外,要注意在胶条水合开始时在胶背上应覆盖矿物油, 以防止胶条水合或随后的IEF过程中水分散失。
样品的制备
取材时应避免因细胞死亡而引起蛋白降解,尽 可能快速将材料投入液氮中保存。研磨时,组 织样品须在液氮中冷冻,充分研磨成细粉,然后 快速加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,充分混匀。 对于大多数植物样品制备而言,在液氮磨碎的 样品中应快速加入蛋白沉淀剂(如丙酮),并在低 温下沉淀(-20oC)和离心(4oC)。
根据胶条长度不同,所需的伏特小时数不同,一般随着 胶条加长而增加。伏特小时数范围从7cm胶条的10 kV到24cm胶条的60 kV以上。最佳聚焦时间即IEF分 离达到稳定态所需时间,是获得最好图谱质量和重复性 的基础。若聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹。但 是过度聚焦会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶 表面渗出(电渗),引起蛋白图谱变形,以及在胶条碱性端 产生水平条纹和蛋白质的丢失。因此,最佳聚焦时间必 须根据不同蛋白质样品、蛋白质上样量和所用特定pH 范围及胶条长度来确定。聚焦完成后,胶条既可以在中 间电压500~1000 V下短时间保持,便于随时进行第二 向的平衡,也可以置于-80oC冰箱中进行长期保存。
盐
– 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 – 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮
离子去污剂
如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，
NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%
固体杂质
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤
第一步是将IEF胶在375 mmol/L Tris-HClpH8.8缓冲液 (含2%SDS、1% DTT或TBP、6mol/L尿素和30%甘油) 中浸泡10~15 min,尿素和甘油是用于减缓电渗效应,提高 蛋白质从第一向到第二向的转移率。第二步是用5% 碘 乙酰胺替代还原剂DTT的375 mmol/LTris-HCl pH8.8缓 冲液,其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化 巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基,以便巯基不能重组形成 二硫键。此外,碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由 DTT,否则自由DTT在第二向SDS-PAGE胶迁移,会产生 点条纹的假象。为减少酰氨基组的烷基化,最好在pH 8~9之间进行还原和烷基化。
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、 修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最 终确定它们的功能
仪器设备
原理
双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质 群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理 化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质 的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子 量的不同将之分离。
管状胶条的制备 :
去离子水2.1ml 30%丙烯酰胺 0.8ml 两性电解质 280ul 尿素3.15g,水浴使 尿素溶解。
20%NP- 40 0.3ml 10%过硫酸铵20ul
TEMED 2.5ul 摇匀后水平注入内径为 1mm 的玻璃管内, 上端留有
一定空间静置待凝, 每次可灌6—8 根。
蛋白质双向电泳
简介
双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、 快速、高分辨率和重复性等优点。1975年,意大利生 化学家O.Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白 质分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了快四十 年的发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上 仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条 水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE 电泳等步骤。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分 子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群 的技术
第一向：等点聚焦
1. 放置电极垫 (?) 2. 200 V 维持 3. 500 V 维持 4. 1000 V 梯度上升 5. 8000 V 梯度上升
1.5h 1.5h 1500vh
支架盖 IPG 胶条
电极
36000vh
电极垫
电压
时间
注意事项
通过高压使得蛋白质按照其等电点特性进行 聚焦
胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过
还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂 可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自 由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦 （TBP）进行还原。
杂质的除去
脂质
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支架
水合溶液：
8M
尿素
2%
NP-40 或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
水合目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
IPG干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶 共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即 使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳 定的pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPG胶灌注 在塑料片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成
固定大小而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现 性有明显提高,主要是因为使用了预制的SDS-PAGE 胶和灌制多板胶的设备,实现了实验系统的标准化,便 于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
要用到的试剂
样品裂解液: 7mol/L尿素,4% CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。 IPG溶胀液: 8mol/L尿素,2%CHAPS,分装成0.5ml/管,-20oC保存。
使用前2.5ml IPG溶胀液加入7mg DTT,0.5%IPG缓冲液(3~10L),少 量溴酚蓝。 平衡液: 50mmol/LTris-HCl (pH8.8),6 mol/L尿素,30%甘油,2% SDS,少量溴酚蓝。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。 溴酚蓝溶液 :1%溴酚蓝,50mmol/LTris-HCl,分装成0.5ml/管,-20oC 保存。 30%丙烯酰胺贮存液: 30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺,0.45um 微孔滤膜过滤后,避光贮存于棕色瓶中4度保存。 凝胶缓冲液储存液： 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8),0.45um微孔滤膜 过滤后,4度保存。 SDS电泳缓冲液 :25mmol/L Tris-HCl (pH8.3),192mmol/L甘氨 酸,0.1%SDS
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成 复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切 酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质 （SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通 过超速离心来去除复合物。
注意事项
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质
IPG 胶条的平衡
平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗
SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析