北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备
一、实验目的
（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理
质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。
碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
三、实验方法
1.仪器用具:
a.无菌操作台(laminar flow)
b.台式型离心机(microcentrifuge)
c.微量吸管(pipetman)
d.真空干燥机(speed vac)
e． 漩涡混合器
f． 琼脂糖凝胶电泳仪
2.材料:
实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 o C下振荡培养过夜。
3.药品及试剂:
a.Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose
b.Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制)
c.Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)
d.RNase A: 1mg/ml
e.TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
f.100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)
g.LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1L
h．酚/氯仿（1：1）溶液
i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）
j .DNA mark er：DL2000
4.实验步驟:
1)将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清
液。
2)沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于
冰上5分钟。
3)加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，
置于冰上5分钟。
4)加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。
5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。
6)以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。
7)加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。
8)以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥
机中10分钟。
9)加入15ul灭菌水，溶解DNA。
10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。
11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。
四、注意事项
1．细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。
4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
