淋巴细胞分离液

实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液。 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌3% NaHCO3调pH至7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。
吸取白细胞层涂片 染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、 5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一 次。
2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管 中，1500rpm 离心10min。
形态法
淋巴母细胞
体积变大 胞浆增多、空泡 核染色质疏松 核仁明显 有丝分裂
教学内容
1 .实验目的 2 .实验原理 3 .试剂与器材 4 .操作步骤 5 .结果判断 6 .注意事项 7 .实验讨论
一、形态学计数法
实验目的
1. 掌握T淋巴细胞转化试验的原理。 2. 熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。
不同类别人类血细胞的密度如下：
红细胞比重为
1.093
多形核白细胞比重 1.092
血小板比重约为 1.032
单个核细胞比重为 1.076～1.090
实验原理
利用一种比重介于1.075～1.092之间等渗的聚蔗糖泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合液（淋巴细胞分离 液），比重为 1.077±0.001，进行密度梯度离心。
6. 置入另一离心管中，加入５倍体积的Hanks液混匀， 1500 rpm离心10min。
7. 弃上清，将沉淀细胞振摇重悬后加Hanks液。 8. 按上述方法洗涤2次。 9. 末次离心后，吸尽上清，再加入Hanks液将细胞悬液体
积还原至1ml。 10. 吸取20l细胞悬液加380l白细胞稀释液混匀2～3min。 11. 吸取15l滴入血细胞计数板中，充池计数白细胞数。
4个蓝色区域为白细胞计数池
结果判断
活细胞可排斥染料不被着色，折光性强 死细胞着蓝色，体积略膨大。 正常情况下，活细胞比例大于95%。
注意事项
1．分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密 度要求不同。 人的细胞密度为 1.0770.001。 大鼠为 1.0880.001。 小鼠为 1.0920.001。 兔为 1.0960.001 等。
离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。
红细胞和多形核粒细胞密度大于分离液，沉于管底； 血小板因密度小而悬浮于血浆中； 单个核细胞的密度略小于分离液，悬浮于分离液上层与
血浆层交界处，呈云雾状白膜层。
血浆
单个核细胞 分离液 粒细胞 红细胞
实验材料
器材:
试管、滴管、吸管、无菌干燥注射器、无菌棉球、橡皮止 血带、水平式离心机、生物显微镜、血细胞计数板等。
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12~20
12~16
核大百度文库、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1~4个 有或无
实验讨论
1. 本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要 求，若需要进一步进行T细胞、B细胞及单核细胞的纯化， 可考虑采用哪些方法？
2. 如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？
福建医科大学 陈敏
实验二 T淋巴细胞转化试验
（验证性实验）
基本原理
同位素法 MTT法
刺激物PHA
T淋巴细胞
增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加
3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min，水
洗，干燥。 5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态
变化，计算淋巴细胞转化率。
结果判断
未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
实验一 外周血单个核细胞的分离 （不连续密度梯度法）
（验证性实验）
实验目的
外周血单个核细胞指淋巴细胞和单核细胞， 是免疫学实验中最常用的细胞群。
在研究免疫细胞时，常常需要先将淋巴细胞 等分离纯化，再进一步进行检测。
实验原理
根据各种血细胞的体积、形态、密度和比重 均有差异，可将不同的细胞分离。
试剂:
1．淋巴细胞分离液（比重1.0770.001）。 2．肝素溶液 用生理盐水配制成500U/ml。 3．Hanks液。 4．2g/L台盼蓝染液。 5．标本 肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。
实验方法
1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hanks液混合
抗凝全血 缓冲液
实验方法
2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细 吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使 稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液 与稀释血液体积比例为1：2）。
2．将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提 高单个核细胞的回收率。
3．向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液 与分离液形成明显界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。
4．为保持淋巴细胞活性，采血后应在2h内分离细胞，尽快 完成操作全程。
5．离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳， 以免影响分离效果。
用含10%小牛血清的RPMI培养液稀释至500～ 1000g/ml。 3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5. 器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭 菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
操作步骤
外周血 0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
3．配平后将离心管置于水平式离心机内，
以2000r/min 离心20min。
分离液
实验方法
4．离心后管内容物从上至下分为四层：
上层为血浆层 中层为细胞分离液 下层为红细胞和粒细胞 上、中层界面处呈现白色浑浊
即为单个核细胞层。
血浆
单个核细胞 分离液 红细胞和粒细胞
实验方法
5. 用吸管插到血浆与分离液的界面处，沿管壁周缘吸出单 个核细胞。