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植物细胞组织培养技术
实验指导书
中国计量学院生命科学学院
二零零六年七月
《植物细胞组织培养》实验指导
目录
实验一、植物组织培养培养基母液的配制
实验二、植物组织培养的培养基配制
实验三、康乃馨的离体快繁
实验四、胡萝卜愈伤组织的建立
实验五、组织培养物的继代培养
实验一组织培养基母液的配制
一、仪器及药品
冰箱、天平（0.0001g）
容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml
广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml
烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml
数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺
标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH
几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品
蒸馏水
二、方法和步骤：
按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：
大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml 或50 ml。
微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成 100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。
铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78 g 和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小
时以上，冷却后定容至1 L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。
有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。
植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后 ,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含 0.1-2 mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。
在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。
表1 N6 朱至清(1975)培养基配方
各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
三、注意事项
1. 如药品所带结晶水不同，应进行换算。
2. 因常用的MS培养基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验采用N6培养基替代MS培养基。
实验二培养基的配制
一、仪器设备及试剂
电炉
天平（0.0001 g）
高压灭菌锅
量筒：l0 ml、20 ml、100 ml、500 ml
烧杯：1000 ml、500 ml、250 ml
移液管：1 ml、2 ml、 5 ml
吸管若干、记号笔
三角瓶或试管、试管架
锡铂纸、玻璃棒
配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。
蒸馏水、pH试纸
蔗糖、琼脂等
1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液。
二、方法和步骤
1 量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基, 先量取约700 ml体积的水。
2 根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。
吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如本实验中培养康乃馨侧芽或茎段时就加入1ml的1 mg/ml的6-BA；而另一个实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1 mg/ml的2,4-D。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。
3 调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定
培养基的pH按照培养材料的要求分别用 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。
4 分装将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。
5 培养基的灭菌一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。
6 培养基的保存消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般
应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。
三、注意事项
