四)液相色谱柱子使用及保养答案

记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的保养（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
✓ 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止 其在流动相中析出
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
样品准备
典型的流速
流动相的保存
有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹 氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡 10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱 气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优 于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
色谱柱的保养（二）
流动相方面Байду номын сангаас
除去微粒 纯度的要求
✓ 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） ✓ 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 ✓ 缓冲液（盐）的浓度 ✓ 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 ✓ 溶剂中的杂质含量 ✓ 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂
流动相对样品的溶解度
✓ 有机溶剂或水的比例
溶剂过滤-除去微粒
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶 剂过滤器以及色谱柱。 遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和 色谱柱的寿命：
������ 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 ������ 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 ������ 每两天更换或过滤溶剂。 ������ 避免溶剂瓶直接日照。 ������ 向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。
2）水相和有机相不要搞混。
溶剂的相溶性
溶剂信息
避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：
������ 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。 ������ 高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。 ������ 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。 ������ 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。 ������ 在有机溶剂中的有机酸溶液。 ������ 含有强络合剂的溶液。 ������ 四氯化碳和异丙醇或THF混合液。
为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护 作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样 品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨 损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
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2 星期
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保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期 1天 新鲜配制
液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养
色谱柱的选择
非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的 C18柱，PH范围2-9（12） 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用 柱
键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺 基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有 柱填料的60-70% 优点∶
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固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
反相HPLC柱（C18）的性能
常规C18填料的稳定性
硅胶基质填料
pH范围：2-8
pH值大于7时 键合相粉碎或溶解
硅 胶 的 溶 解 曲 线
pH值小于2时 键合相的化学键断裂
溶剂截止波长
溶剂准备：脱气
流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶 解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动 相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气 泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降， 甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些 组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分 离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
样品过滤头的类型：
30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品 体积少于50μl。
13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格,材料为纤维素。
3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm 和0.45μm 两种规格。处理样品体积为7μl。
经常用缓冲液
固定相降解
填料新的键合技术
- PH范围 2-12
- 稳定性好，使用寿命长
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效
色谱柱的使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱
流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
溶剂准备：过滤
选择合适的滤膜
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可 溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推 荐用于蛋白质和其相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于 强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性 样品和有机溶剂。 注意：1）每张滤膜只能用一次。