分子荧光分析法

荧光熄灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶
质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
荧光熄灭剂：能够引起荧光熄灭的物质。
如： X离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合
物、重氮化合物和羧基化合物。
五种形式: ① 荧光物质的分子和熄灭剂分子发生碰撞而损
失能量。 ② 荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成本身
不发光的配位化合物。 ③ 荧光物质分子中引入溴或碘后易发生体系间
因此，同一型号的仪器，甚至同一台仪器 在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。 故使用前需进行灵敏度校正。
一般地，在每次测定时，在选定波长及狭 缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质 配成浓度一定的标准溶液进行校正，将每次 测得的荧光强度调节到相同数值（50%或 100%）。
通常在紫外-可见光范围内用1ug/ml的硫酸 奎宁标准溶液（0.05mol/L的硫酸中）进行校 正，因其产生的荧光十分稳定。
六 荧光分析仪器 用于测定荧光强度有滤光片荧光计、滤光片单色器荧光计及荧光分光光度计三种类型。
第一种类型仪器不能测定光谱，可进行定量 分析； 第二种类型仪器不能测定激发光谱，但可测 定荧光光谱； 第三种类型仪器既可测定激发光谱，又可测 定荧光光谱。
1 荧光分光光度计
主要构造：激发光源 单色器 检测器系统
称荧光。
荧光的波长总比激发光的波长要长?
④ 外转换：external conversion 如果分子在溶液中被激发，激发态分子与溶 剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能 量，以热能形式放出，此过程称为外转换。 通常发生在第一激发单线态或第一激发三线 态的最低振动能级向基态转换的过程中，会降 低荧光或磷光强度。
迁，π电子共轭程度越大，荧光强度越大， 荧光波长长移。
例：苯、萘、蒽的荧光强度比较。
ex 205nm
em 278nm
0.11
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
B 分子的刚性和共平面性
刚性：指分子自由旋转程度的大小，若分子 不能旋转，则为刚性分子。
共平面性:指共扼π电子的共平面程度。在长 共轭分子中，刚性和共平面性越大，荧光效 率越大，荧光波长长移。
⑥ 磷光发射： 激发单线态最低振动能级体系间跨越激发
三线态高振动能级 振动驰豫 激发三线态 最低振动能级（存活） 发射磷光 基态 各振动能级振动驰豫、外转换基态最低振动能级
与荧光比较：过程比荧光长（104 10S ）
磷光波长较荧光长?
综上所述的能量释放方式中：
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫、内转换、
3.优点：
灵敏度高，选择性好。 紫外 可见分光光度法检出限 107 g / ml
荧光分析法检出限为1010 1012 g / ml
二 基本原理 1 有关概念 单线态：
大多数分子含偶数个电子，成对地填充 在能量最低的各轨道中，根据Pauli不相 容原理，轨道中的两个电子具有相反方 向的自旋，即自旋量子数为+1/2和-1/2， 其总自旋量子数为0。用2S+1表示电子 能态的多重性，基态所处的电子能态为 单线态。
七 定量分析方法
1 荧光强度和荧光物质浓度的关系
荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度
即：F∝（ I0 － I ）
F=K（ I0
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）
I0
I
根据Beer定律：I I 010 ElC F
代入上式后，展开得：
F

K I 0
2.3ElC
6 散射光的干扰
散射光主要有瑞利光和拉曼光两种： 瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不
发生能量的交换，仅是光子运动方向发生改 变。其波长与入射光波长相同。
拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时, 光
子运动方向发生改变，能量交换，发射光比 入射光波长稍长或稍短的光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光，因其波长与荧光波 长接近，对荧光测定的干扰更大。
强 320
度
a
360
448
激发320 nm 硫酸奎宁
350 448
激发350nm 硫酸奎宁
强 320
度
b
360
激发320nm 0.1mol / LH2SO4
350 400
激发350nm 0.1mol / LH2SO4
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
无论选择320或350nm为激发光，荧光 峰总在448nm，拉曼光波长分别为360和 400nm，其中，400nm的拉曼光对荧光的 测定有干扰。
第三类基团：-R、-SO3H等 对荧光的影响不 明显。
五 影响荧光强度的外部因素
1 温度： 温度越高，荧光效率及荧光强度越低。因为 温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞 几率增加，使无辐射跃迁增加，降低了荧光 效率。
2 溶剂： ① 一般情况下，荧光波长随溶剂极性增大而长
移，强度也有所增加。
② 荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。溶剂粘 度减小时，可增加分子间碰撞机会，使无辐 射跃迁增加而使荧光减弱。
作用：鉴别荧光物质； 选择适当的荧光测定波长。
激发光谱和荧光光谱类似“镜像对称”关系
荧 光 强 度
300nm
400nm
500nm
硫酸奎宁的激发光谱（虚线）及荧光光谱（实线）
3 溶液荧光光谱的特征
A 斯托克斯位移：Stokes shift
1852年，Stokes首先观察到：溶液荧光光谱中， 荧光波长总是大于激发光波长。
分子荧光分析法
Molecular fluorescence spectrophotometry
一、概述
1 光致发光：
当某些物质受到光的照射时，除吸收某种波
长的光之外还发射波长相同或比吸收波长更长
的光，这种现象叫光致发光。
荧光 fluorescence:
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发
态的最低振动能级返回至基态时发射出的光。
外转换、体系间跨越。
三、激发光谱与发射光谱
1激发光谱：excitaton spectrum
不同激发波长的辐射引起物质发射某一波 长荧光的相对效率。即固定荧光波长，以荧 光强度（F）为纵坐标，激发波长（λex）为 横坐标作图可得。
2 发射光谱：fluorescence spectrum
即荧光光谱，使激发光的波长和强度保持 不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长 下相应的荧光强度，记录荧光强度（F）对发 射波长（λem）的关系曲线。
磷光 phosphorescence:
吸收光子
激发
三线态最低
振动能级
基态
2 荧光分析方法
Fluorometry
根据物质的荧光谱线位置及其强度进行
物质鉴定和物质含量测定的方法。
X射线荧光分析法 X-ray fluorometry 原子荧光分析法 atomic fluorometry 分子荧光分析法 molecular fluorometry
联苯
c
H 2芴
0.2
1.0
C 取代基：
增加分子的π电子共轭程度的取代基,增强荧 光，并使波长长移； 减弱分子的π电子共轭程度的取代基，使荧光 减弱或熄灭。
属第于一给类电基子团基：团-N，H2增、强-O荧H、光-。OCH3、-CN等，
第二类基团：-COOH、-NO2、-NO、-Cl -Br、 - I等，减弱分子的π电子共轭性，使荧光减弱 甚至熄灭。
发射荧光的光子数
吸收激发光的光子数
任何物质的 在0～1之间，如荧光素在 水中 =0.65，蒽在乙醇中 =0.30，菲在 乙醇中 =0.10。
荧光效率低的物质虽有较强的紫外吸收， 但所吸收的能量都以无辐射跃迁形式释放， 所以没有荧光发射。
2 与分子结构的关系
A 长共轭结构：
芳香环或杂环具有长共轭的跃π π*跃
V1
V0
VV23
V1
T1
V0
S0
VV23
V1
V0
荧光与磷光产生示意图
发射荧光过程约为 109 107 S ，返回基态 时，可停留在任一振动能级上，因此，可得几 个非常靠近的荧光峰谱线。
有关概念： ① 振动弛豫：vbrational relexation
物质分子被激发后，其电子可能跃迁到第一 电子激发态或更高的电子激发态的几个振动能 级上，在溶液中，激发态分子通过与溶剂分子 碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电 子则返回到同一电子激发态的最低振动能级上， 此过程称为～。
原因：内转换、振动驰豫达到第一激发单线态 的最低振动能级；激发态分子与溶剂相互作 用；激发态分子返回到基态的各不同振动能 级，进一步损失能量。
B 荧光光谱的形状与激发波长无关：荧光发射 通常发生于第一电子激发态的最低振动能级； 而与激发到哪一个电子激发态无关。
四 分子结构与荧光的关系
物质能否产生荧光，主要取决于物质结构及 环境条件。 1 物质产生荧光的必要条件 ① 物质分子必须有强的紫外-可见吸收。 ② 物质必须具有较高的荧光效率。 荧光效率（fluorescence efficiency）又称荧光 量子产率（fluorescence quantum yield）
② 内转换：internal conversion
当两电子激发态之间能量相差较小以致其振动 能级有重叠时，受激分子将多余的能量转变为 热能而跃迁至较低电子能级。
③ 荧光发射：
无论分子最初处于哪一个激发单线态，通过内 转换及振动弛豫，均可返回至第一激发单线态 的最低振动能级上，然后再以辐射形式发射光 量子而返回到基态的任一振动能级上，所发射 的光量子即
除电子自旋方向改变外，能量亦不相同。
E




基态


激发单线态 激发三线态
3 荧光的产生
荧光的产生过程：
基态吸收辐射 激发单线态 内转换、振动驰豫 第一激发单线态的最低振动能级 发射荧光 基态的各振动能级外转换、振动驰豫 基态的最低振动能级
S
2
VV23
V1
V0
内转换
S1
VV23
体系间跨越
样品池
样品池
表
面
吸
光源
激发单色器
光
物
发射单色器
质
指示器
记录器
放大器
检测器
荧光分光光度计结构示意图
2 荧光分析仪器的校正
① 灵敏度校正
影响荧光分光光度计灵敏度的因素很多， 与仪器的光源强度、单色器性能、光电管的 灵敏度及放大系统的特征有关；与波长、狭 缝宽度有关；还与被测定的容器、溶剂等的 杂散光有关。
当基态分子的一个电子吸收光辐射被激 发而跃迁至较高的电子能级时，电子不发 生自旋方向的改变，此时分子处于激发的 单线态。
激发三线态：
电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子 具有两个自旋不配对的电子，总自旋量子 数为1，处于激发的三线态（2S+1=3）。
2 基态、激发单线态、激发三线态比较
如图所示，激发三线态和激发单线态
⑤ 体系间跨越：intersystem crossing
指处于激发态分子的电子发生自旋反转而使 分子的多重性发生变化的过程。如果第一激 发单线态的最低振动能级同激发三线态的最 高振动能级重叠，那么激发态分子的电子发 生自旋反转，分子由激发单线态跨越到激发 三线态，荧光强度减弱或熄灭。
含有重原子如Br2、I2等的分子，体系间跨 越最常见，因为电子的自旋与轨道运动之间 的相互作用较大，有利于电子自反转的发生。 溶液中存在的氧分子等顺磁性物质也容易发 生体系间跨越，从而使荧光减弱。
跨越而转变至三线态。
④ 溶解氧的存在使荧光物质氧化或由于氧分子 的顺磁性促进了体系间跨越，使激发单线态 的荧光分子转变至三线态，从而引起荧光熄 灭现象。
⑤ 荧光自熄灭现象：当荧光物质浓度较高时， 由于荧光分子间碰撞几率增加而损失能量， 使荧光熄灭。
荧光熄灭法：
利用一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧 光强度的减小和荧光熄灭剂的浓度呈线性关 系，可以测定荧光熄灭剂的含量。
③ 若溶剂与荧光物质形成化合物或溶剂使荧光 物质的电离状态改变，那么，荧光峰的波长 和荧光强度将发生变化。
3 pH的影响： 每种荧光物质都有最适宜的pH范围
如：苯胺在不同的pH下的荧光效率不同。
NH
3
pH＜ 2
OH
H
OH
NH 2
H
pH7～12
NH
pH＞13
无荧光
蓝色荧光
无荧光
4 荧光熄灭剂的影响：
② 波长校正
若仪器的光学系统或检测器有变动，或在 较长使用时间之后，或在重要部件更换之后， 可用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度重新 校正。
③ 激发光谱和荧光光谱的校正
测得的激发光谱和荧光光谱往往是表观的， 其原因较多，最主要原因是光源的强度随波 长而变及每个检测器对不同波长的光的接受 敏感程度不同，及检测器的感应与波长不呈 线性。故应用仪器上的校正装置将每一波长 的光源强度调整一致。