琼脂糖凝胶电泳方法DNA样品的纯化和定量检测方法

4.待凝胶溶液冷至50℃左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5μ g/ml）， 摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。
琼脂糖凝胶电泳方 法
5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽 约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后 小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。
6．待测的DNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液 （6×loading Buffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分 之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指 示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。
7．打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压 不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)。
பைடு நூலகம்
琼脂糖凝胶电泳方 法
1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压 电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现 渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样 梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。
3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百 分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电 泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。
实验材料

酚：氯仿：异戊醇（25：4：1） 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统
染色体DNA的制备方法
1. 将800ul抗凝储冻血液置室温溶解。 2. 往管中加2ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上15分钟，期间间歇摇动 几次，看管底沉淀，悬浮沉淀。 3. 6000rpm，室温离心10分钟，弃上清。 4. 往管中加入4ml红细胞裂解液，轻摇几次后，冰上5分钟，期间摇几次， 看管底沉淀，摇动试管悬浮沉淀。 5. 6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 6. 重复步骤4、5，1-2遍（视红细胞洗净程度而定），至沉淀白色。 7. 用1×PBS 4ml洗涤所得沉淀，混匀，冰上5分钟，期间摇动几次。 8. 6000rpm，4℃离心5~10分钟，弃上清。 9. 每管中加入500μ l白细胞裂解缓冲液，重悬细胞，加入20μ l proteinase K（20mg/ml），混匀后置55℃水浴1小时，至溶液清亮（澄清）。
8．电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA 各条条带分开后，可以结束电泳。一般20分钟~2小时，取电泳凝胶块直接 用凝胶成像系统成像和分析。
实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测
实验目的

通过实验学习从血液中制备染色体DNA的 方法。
学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、 DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。


实验原理

红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞
用蛋白酶K水解蛋白质
实验原理



纯净的DNA A260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8 纯净的RNA A260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋 白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉 淀DNA； A260/A280>2，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用 酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； 如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高， 样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质 会使A260/A280比值下降。
实验材料
红细胞裂解液 KHCO3 1g NH4Cl 8.3g EDTA· Na2 37mg (10mM) (155mM) (0.1mM)
裂解缓冲液（lysis buffer） 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下 保存数天或-70℃下长期冻存，备用。
染色体DNA的制备方法
10. 用酚-氯仿（350μ l+350μ l）、氯仿（450μ l）分别抽提一次，每次 抽提后10000rpm，4℃离心5分钟，取上清（不要吸入有机相）。 11. 上清中加入2倍冰预冷无水乙醇和0.1倍3M NaAc。冰上20分钟或-20℃ 过夜。 12. 12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1-2次，12000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 14. 室温干燥沉淀5分钟。 15. 加入100μ l DDW（无菌水），37℃水浴至DNA溶解。 16. 取样品10μ l，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品。 17. 相对完整的染色体DNA在电泳图中只出现一条分子量较大的条带，不 会出现条带弥散现象。 18. 取样品10μ l，稀释100倍，测A260和A280，计算DNA浓度。
有机溶剂酚、氯仿抽提


在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA
再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA
实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者 则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其 等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在 用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效 应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应， 使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异 所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压， 也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。